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動物醫學論文范文 第1篇
題目：風險評估在動物疫病及動物產品上的應用
摘要：通過對近年來風險評估技術在動物疫病和動物產品上的應用情況的研究，從國內外兩個方面進行闡述，綜述了國外風險評估體系及應用現狀和國內的應用進展，并針對我國目前風險評估體系建設情況提出了相應的建議。風險評估技術在動物及動物產品上的應用主要包括動物疾病的檢測和預警以及動物產品的加工過程的監控。
關鍵詞：沙門疫病動物
風險評估是系統地采用一切科學技術及信息，在特定條件下，對動物、植物和人類或環境暴露于某危害因素產生或將產生不良效應的可能性和嚴重性的科學評價。風險評估技術在國外動物疫病控制和食品安全方面得到了廣泛系統的發展和應用。我國農業部在2002年成立了動物疫病風險評估小組，依據世界動物衛生組織(OIE)的有關規定對中國動物疫病進行了風險評估，在2009年6月正式實施的《中華人民共和國食品安全法》提出了加強食品風險評估體系建設。近年來，我國在動物疫病和食品安全方面初步建立了風險評估體系，盡管在某些方面取得了一定的成績，但是在技術上和應用程度上都與發達國家存在很大差距。
1 發達國家建立了重大動物疫病控制系統
在動物醫學領域中，口蹄疫、藍舌病、非洲豬瘟、牛海綿狀腦病、高致病性禽流感等傳染病的監測中都有風險評估方面的研究。許多發達國家都建立了重大動物疫病控制系統，不僅為風險評估提供大量真實的數據，而且可以通過與地理信息系統(Geographic information system，GIS)技術的結合，對疫病的發生進行預警，從而判斷和控制動物和人群中疾病的發生，大大降低了由動物疫病帶來的各方面損失 [1]。如荷蘭通過對574個家禽飼養場進行禽流感的風險因素調查發現，禽流感的傳播與禽舍的類型和周圍是否飼養其他動物的關系不大，而飼養場之間的蛋托和蛋箱的使用會增加禽流感傳播風險 [2]。Andraud M和RoseN等 [3-5]在2010建立了豬圓環病毒病在豬場中傳播的風險分析模型，該模型是個體動物為基礎產生隨機模型與豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)的流行病學動力學模型的結合，所涉及的主要參數來自于2008年發表的感染試驗的論文，該論文是對豬圓環病毒在窩內及窩與窩之間進行傳播的各種相關參數定量確定 [6]。而在2009年，Rose N等 [7]用以連續清楚的過程展現了風險分析在規模化豬場上的引用。首先采用豬場實地調研確定了豬斷奶后多系統衰弱綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)在豬場傳播的風險因素，確定了在豬場管理中疫苗免疫的重要性，將它作為重要因素放入個體動物的動態隨機模型中。再通過對風險因素的確定，各種試驗確定相應的模型參數，制定最后的數學模型。Katharina D C等 [8]在2002年做的一個假設，豬由于飼喂進口受污染的飼料使豬發生感染的定量風險評估，該評估構建了豬暴露于受污染飼料的概念模型圖。
新西蘭農林部動物生物安全機構的有關專家，對口蹄疫傳入新西蘭進行了風險評估。新西蘭主要動物疫病控制系統是EpiMAN，系統最初開始實施于口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)，疾病由空間數據、文本數據和流行病學的知識組成數據庫，將疾病和相關因子的流行病學與可確定因子將在哪些地方發生的GIS技術結合起來，從而描述在環境因素影響下的疾病空間分布。美國動物衛生和流行病學中心負責將通過監測等途徑獲得各種緊急動物疫情信息，并通過風險評估、流行病學分析、地理空間分析等多種手段對某種重大疫病可能對美國畜牧業造成的影響以及可能發生程度進行預警性風險分析，提出最佳應急方案。英國國際動物衛生處下設的國際動物疫情監測組，24h內形成《國外動物疫情定性風險分析》報告在英國農業部網站發布。歐盟的預警體系包括畜禽及其產品交易監測網絡、實驗室監測網絡等多個監測網絡。該體系中包括了重大動物疫病通報系統(Animal disease notification system，ADNS)、人畜共患病通報網絡等疫情報告系統。歐、美等國家對采取疫苗注射預防口蹄疫的國家和地區進行免疫畜群抗體水平的長期監測，尤其是對受威脅地區的抗體監測。從而確定免疫時間和免疫程序，并通過對自然感染動物抗體監測來進行發病危害性評估 [9]。
2 我國初步構建了生豬疫病的風險評估基本框架
在我國動物衛生檢疫工作中，風險分析也逐漸成為預防控制傳染病的一種重要科學依據。通過風險評估，確定危害等級或危害程度，提出進行風險管理的具體措施，以達到控制傳染病傳入的目的。重大動物疫病狀況評估，是基于風險評估理念，著眼于動物及動物源性產品的飼養、生產、運輸消費的監管、檢疫以及動物疫病控制等環節，以重大動物疫病狀況為因變量，設定特定區域和特定時期內的動物疫病狀況影響因素為變量，從而對相應時期和相應區域的重大動物疫病狀況水平進行的宏觀評判 [10]。
總結近些年來國內外對動物疫情風險分析的研究文獻，目前我國動物疫病的定量風險評估主要是利用蒙特卡洛模型對疾病分布進行擬合，得出相應參數和分布類型。其中比較具有代表性的是李亮等 [11]利用蒙特卡洛法進行了風險評估的定量研究，以安徽省生豬為例，針對豬瘟、豬丹毒、豬肺疫等3種主要生豬疫病的風險分布進行擬合，利用蒙特卡洛模擬法得出了各自的風險分布類型及參數，證明Lognormal分布為3種疫病風險的最優分布。閆麗君等 [12]通過將疫病風險與生豬死亡數之間的關系進行量化，利用蒙特卡洛模型模擬來解決樣本不足的問題。運用極值POT模型對我國生豬疫病災害損失尾部分布進行r有效擬合，構建了生豬重大疫病損失的廣義Pareto分布模型。利用風險價值法，實證分析和度量了我國生豬疫病發生的風險水平，計算出我國不同等級的生豬疫病風險損失的95%置信區間，并提出減輕和控制我國生豬重大疫病風險的政策建議。現代極值法與蒙特卡洛擬合法相比，避免了在分析極端事件的不足以及可以實現疫病風險的數字化。白金等 [13]根據現場調查、專家評議、風險矩陣分析等方法，確定了規模豬場豬瘟發病的各項風險因素;采用兩兩比較和層次分析法，分別計算出各項風險因子的組合權重系數，初步建立了風險評估模型。在對于其他動物方面，孫向東等 [14]探究影響奶牛布魯菌病風險評估的主要因素及其影響順序。從飼養與調入、繁育、飼養環境、混養情況四個方面，設定了評價指標體系，選取3個有代表性的地區進行了調查，應用系統多層次灰色關聯熵分析方法進行奶牛布魯菌病風險評估。
3 國際組織和發達國家建立了完善的動物產品風險評估體系
由于大多數發達國家根據國際組織的相關文獻分析、細化風險分析的各種因素，通過建立風險評估將動物疫病控制得較好 [15]，但來自畜產品加工等過程中污染的微生物對人類健康帶來的風險遠遠高于動物疫病本身。國際組織和很多發達國家建立了對人類健康影響較大的致病菌風險評估體系，并發表了風險評估報告。目前聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization，FAO)與世界貿易組織(World Trade Organization，WTO)建立了幾種微生物比較完善的微生物風險評估報告，其已經出版六個報告系列叢書：《沙門菌在雞蛋和肉雞中的風險評估一》，《沙門菌在雞蛋和肉雞中的風險評估二》，《病原體在食物和水中危害特征描述的指導原則》，《即食食品中單核細胞增生李斯特單胞增生菌風險評估的說明概要》，《即食食品中單核細胞增生李斯特單胞增生菌風險評估技術報告》，《強化嬰兒食品中阪崎腸桿菌危害評估會議報告》。除此之外，FAO與WHO還進行了肉雞中溶血性弧菌及海產品中霍亂弧菌的風險評估等其他微生物評估。不僅如此，國外對多種致病菌進行了風險評估的研究。例如，對大腸埃希菌O157的風險評估研究，Perez-Rodriguez F等 [16]建立了大腸埃希菌(O157：H7)在生鮮萵苣葉上的生長模型，模擬在商業工業的加工中的生長模型得到不同溫度下最大生長率。Buchanan R L等 [17]研究了pH、NaCl濃度、溫度和氧氣對大腸埃希菌O157：H7的生長的影響，并根據得到的數據進行Gompertz方程擬合，修改了Gompertz方程的B和M參數，建立了一個基于Gompertz方程B和M參數自然對數變換的二次模型，從而建立了大腸埃希菌O157快速增長估計模型 [18]。Cassin M H等 [19]將定量風險評估(quantitative risk assessment，QRA)、情景分析和預測微生物學結合起來對大腸埃希菌O157：H7進行了定量評估，通過控制不同的pH、水分活度及氯化鈉濃度來測定該菌的生長情況，對牛肉漢堡中的大腸埃希菌O157：H7建立了過程風險模型(process risk model，PRM)。該模型對病原體在食品生產過程中的加工、處理、消費進行了估計，并作為食品消費與健康的暴露評估。用蒙特卡洛模擬風險預測模型中的不確定性與變化性，通過對模型中預測因子的修改，可以顯著降低感染大腸埃希菌0157：H7。其他微生物方面，Greinwea M等 [20]將貝葉斯域來補充蒙特卡洛模型不能處理模型參數的反饋的缺陷，用來構建完整的定量風險評估模型。西班牙學者是將統計學和二階蒙特卡洛模型研究老人人群食用熟肉食感染李斯特菌的情況 [21]。Belda-Galbi C M等 [22]和Coulliette A D等 [23]研究不同的因素來降低對大腸埃希菌、李斯特菌和沙門菌等的感染風險。
4 風險評估技術在我國動物產品安全中得到初步推廣和應用
我國的動物衛生風險分析起始于20世紀90年代中期，發展于21世紀，先后開展了大量動物衛生風險分析理論研究與應用，一些省份也建立起了動物衛生風險評估的組織和制度體系。為了加強食品安全風險評估在我國食品安全監管中的應用，我國頒布的《食品安全法》中規定，成立食品安全風險評估專家委員會開展食品安全風險評估工作，并將結果作為制定或修訂食品安全標準和對食品安全實施監督管理的科學依據。
目前，我國已啟動了食物中毒菌中的沙門菌和大腸埃希菌O157：H7的定量風險評估，旨在通過食物中毒暴發的調查和運用數學模型，估計引起食源性疾病的最低活菌攝入量或造成50%食用者發病的活菌量。在沙門菌方面，我國已經開展了大量工作，趙志晶等 [24]進行了中國帶殼雞蛋中沙門菌定量危險性評估的初步研究，該評估模型模擬了從農場到餐桌(即從生產到消費)由于消費帶殼鮮雞蛋引起沙門茵病的危險性，文中使用了大量的假設并且數據也十分有限，僅是為以后評估提供了一個框架，需要新的資料來不斷完善其模型。王歡等 [25]通過@Risk軟件推測合肥市地區市售雞肉沙門菌的流行率進行雞肉中沙門菌的食品安全風險評估，但沒有對暴露評估中可能發生的人體攝入量進行評估。趙瑞蘭等 [26]通過對沙門菌在不同條件下生長情況的研究，建立了不同溫度下營養肉湯、雞肉中沙門菌的生長模型，以及不同條件下沙門菌的失活/存活模型，但這些模型僅為一級生長模型，缺少實際應用的意義，但為下一步建立二級生長模型打下基礎。王軍等 [27]對我國豬肉產品致病微生物的污染狀況及影響因素進行了調查，沒有根據食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission，CAC)的推薦步驟進行風險評估，也沒有建立豬肉產品質量安全風險評估模型。董慶利等 [28]對某市開展了即食食品中單增李斯特菌的半定量風險評估，構建了即食食品中單增李斯特菌的風險矩陣，由風險可能性和風險損失度計算得到易感人群通過攝入即食食品感染單增李斯特菌的風險等級。駱璇等 [29]運用大量假設和@Risk軟件對上海市豬肉中金黃色葡萄球菌進行定量風險評估，論文中存在大量不確定性，但為今后開展完善豬肉產品中金黃色葡萄球菌風險評估提供參考。基于OIE風險分析框架和FDA152號抗菌藥物耐藥性風險評估指南，馬立才 [30]結合我國細菌耐藥風險評估的現狀建立了肉雞源細菌耐藥性定性風險評估模型。在評估過程中使用“矩陣法”和“非矩陣法”兩種方法對風險參數進行整合。
5 啟示
由于我國國家食品安全風險評估專家委員會成立較晚，各項工作仍處于起步階段，食品風險評估工作與上述發達國家之間還存在很大差距，風險評估運行機制還不夠完善。主要表現為：檢測技術相對落后，專業人員不足，獲得評估數據和評估結果缺少可信度，管理透明度和評估工作獨立性有待于進一步加強。此外，風險評估標準多為從國外直接引入，沒有真正地了解標準制定的詳細過程、重要依據、現實情況以及國外的相關規定，導致了錯誤食品安全信息的存在和流傳。風險評估中模塊化過程中風險模型僅能評估當前風險而未能考慮流通領域的風險因素和危害溯源等缺陷，都需要我們進一步的改進。評估風險因素對食品產品安全的影響程度，管理者通過綜合考慮控制效果和成本能夠選擇合適的風險控制措施，為企業在生產流通過程中預防和管理安全風險提供有力的工具，體現其應用價值 [31]。
我們要認識到動物及動物產品風險評估的作用十分重要：可以為動物的疫病的檢測和預防提供基礎信息;可以為動物產品標準的制定提供科學依據。為確定進一步的風險監測和管理的優先內容提供科學依據;一個政府制定的相關的食品安全管理措施，哪怕是一個標準，或者是一個規章制度，到底在實施以后有沒有效果，都要在實施前后進行風險評估。
風險評估的技術在不斷發展，我國也要不斷借鑒國外的先進技術和經驗，進一步的探索和完善我國的風險評估，應建立動物衛生風險評估管理機制，使風險評估可以發揮更大的作用。
動物醫學論文范文 第2篇
題目：熱應激對動物心肌細胞影響研究進展
摘要：熱應激是動物飼養過程中經常遇到的難題，給畜牧業帶來了較大的損失。由于心臟對熱的敏感性較高，當動物機體遭受熱應激損害時，首當其沖的器官往往是心臟。所以，如何提高心臟抵抗熱應激的損傷，成為養殖業日益關注的焦點。論文從熱應激對心臟的影響、心肌細胞在熱應激作用下的組織形態學變化、熱應激損傷心肌細胞的機制、熱應激作用下心肌細胞的自我保護及如何提高心肌細胞對熱應激的抵抗能力方面，結合近年來的研究做一綜述。
關鍵詞：熱應激;心肌細胞;損傷
熱應激(heat stress)是動物集約化飼養中經常遇到一大難題，給動物的生長、繁殖帶來較大的損失[1]。例如籠養肉雞常常因為受到急性熱應激而猝死，即使在慢性熱應激下也會因為食物消耗率低、代謝受阻而生長緩慢。
心臟是熱應激較為敏感的器官。從宏觀角度分析，當動物處于熱應激狀態下時，高溫刺激體溫調節中樞-下丘腦，并在下丘腦的調節下，機體加快散熱，呼吸加快，體表血液流動加快，其心率也會加快，從而加重了心臟的負擔，容易造成心肌損傷;從微觀角度觀察，有試驗表明，心肌細胞在持續熱應激作用下會發生嚴重的腫脹、變性[2]。當心肌受到損傷時，動物的健康也就受到了嚴重的威脅。所以，保護心肌細胞免受熱應激的損傷成為當下研究熱應激的熱點之一。在國內外的研究中，持續的熱應激往往造成心肌細胞的凋亡，然而熱應激誘導心肌細胞凋亡的機制還不是很清晰。本文就近年來有關熱應激對心肌細胞影響的研究進行綜述，為探討熱應激對心肌的影響機制提供參考。
1 熱應激對心臟的影響
心臟是動物機體循環系統中最重要的器官，當動物處于熱應激狀態下時，首當其沖的器官往往就是心臟。眾所周知，當高溫刺激下丘腦溫度調節中樞時，機體表現出呼吸加快，心率加快，體表血液流速加快。持續的熱應激會給心臟帶來較大的負擔，最終導致心臟衰竭。
有研究學者將肉雞置于不同高溫下，并在不同的時間段檢測肉雞股動脈壓和右心室內壓，發現股動脈壓顯著下降，且溫度越高，股動脈壓下降的速度越快;而通過記錄不同時間段的右心室內壓，可以計算出右心室內壓的最大變化速率，右心室內壓的最大變化速率可反映出右心室收縮和舒張的功能狀態。實驗表明右心室內壓的最大變化速率顯著下降，說明右心室在熱應激作用下損傷嚴重[3]。
與上述試驗相類似，高俊濤等[4]對SD大鼠做左心室插管手術，并檢測可以反映心肌收縮力的等容收縮期左心室壓力的最大值(left ventricular systolic pressure，LVSP)以及反映心臟功能狀態的左心室等容收縮期壓力變化最大速率(+dp/dt)等相關指標，發現在熱應激初期LVSP，+dp/dt均逐漸升高，而1 h后兩者均顯著下降，反映出長時間的熱應激造成左心室收縮力下降以及使心臟出現功能障礙的現象。提示，持續熱應激會給動物心臟造成嚴重的損傷。
2 熱應激作用下心肌組織形態學變化
處在熱應激狀態下的動物，經常會出現熱休克和猝死現象。雖然這種熱休克和猝死是由多種原因引起，但心肌細胞往往最先遭受到嚴重的熱應激損傷。Wu Di等[5]將肉雞置于熱應激狀態下并對其心肌細胞做組織切片觀察，熱應激1 h之后，發現心肌細胞出現腫脹狀態;熱應激5 h之后，出現心肌組織萎縮、心肌細胞核固縮;熱應激15 h之后心肌細胞出現空泡變性、心肌纖維之間的間隙變大等特征。心肌組織的這種變化不僅僅出現在肉雞中，Islam A等[6]通過對大鼠心肌細胞進行體外培養，然后將培養的心肌細胞放置在42℃環境下，觀察心肌細胞在不同時間段內的變化，最終發現體外培養的大鼠心肌細胞出現與上述實驗現象相似的組織形態學變化。提示熱應激會給動物心肌組織造成嚴重的損傷。
3 熱應激損傷心肌細胞的機制
根據上述心肌組織學變化可知，當動物長時間處于熱應激狀態下時，熱應激損傷的最終結果是導致心肌細胞的凋亡。此外，心肌組織處在熱應激下會在血清中釋放一些重要的酶，如肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)等[7]，同時產生大量的自由基。通過檢測血清中生化指標的變化，可以從側面反映出心肌細胞在熱應激作用下受到的傷害。
3.1 熱應激作用下心肌組織內的生化指標的變化
CK和CK-MB在心肌組織中的含量豐富，兩者聯合LDH是檢測心肌損傷的重要生化指標[8]。李昌武等[9]在試驗中證實，當小鼠處在熱應激狀態下，其血清中的CK、CK-MB和LDH活力均呈上升趨勢，提示心肌在熱應激下而受損。這與仲慶振等[10]在研究急性熱應激對鵝心臟損傷中所測得的CK活力上相一致，同樣與井然等[11]所測得的高溫環境中大鼠血清中LDH和CK-MB活力顯著升高相一致。如此以來，便可以通過檢測動物血清中相關酶的變化，方便而快捷的診斷出動物心肌細胞受到熱應激損傷的程度，同時尋找降低這些酶活性的方法，便可以減輕熱應激對動物心肌的傷害。
3.2 熱應激誘導的心肌細胞凋亡機制
目前國內外研究中，關于熱應激誘導的細胞凋亡機制還不甚清晰。Slimen I B等[12]指出熱應激可以引起細胞的氧化應激，而氧化應激可通過多條途徑介導細胞凋亡，提示熱應激是通過多種途徑誘導細胞凋亡的。最近有學者提出，較長時間的熱應激可觸發心肌細胞的內質網應激，進而進入內質網的信號凋亡途徑[13]。然而，內質網的信號凋亡途徑會與線粒體凋亡途徑相匯合，其凋亡的最后一步依然由線粒體釋放細胞色素C，激活caspase-3而最終導致細胞凋亡[14]。
王曉武等[15]將小鼠置于潮濕高溫環境下，發現其心肌細胞凋亡率明顯高于對照組，同時檢測到血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)大量生成，而AngⅡ可通過P38 MAPK信號通路使caspase-3活化，以及聯合濕熱環境誘導的氧化應激產生高濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，最終導致細胞凋亡[16]。由此可知，熱應激既可以通過內源性通路，也可以通過外源性通路誘導細胞凋亡。
有研究發現熱應激可以引起心肌細胞內鈣離子超載以及機體的氧化應激，導致線粒體膜通透性的改變，并釋放出細胞色素C，從而誘導心肌細胞的凋亡[17-18]。提示線粒體在心肌細胞中的重要作用，增強心肌細胞抵抗熱應激引起的凋亡的，其關鍵就在于保護心肌線粒體。
4 熱應激作用下心肌細胞的自我保護
眾所周知，當細胞受到熱應激或其他應激時，胞質內會迅速大量合成一類具有分子伴侶功能的蛋白質——熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)。同樣，心肌細胞也能合成Hsp。其中Hsp70是得到廣泛研究的一種熱休克蛋白。Hsp70已經被證實可以抑制心肌細胞的凋亡，但其抑制凋亡的機制尚不清楚。
近年來Hsp70的抑制細胞凋亡的機制不斷被發現，例如Hsp70可以抑制Fas介導的應激性心肌細胞凋亡[19]。然而，Hsp70在心肌細胞中的含量隨著熱應激時間的延長而逐漸降低，而當Hsp70降到最低水平時，心肌細胞也出現了嚴重損傷。提示Hsp70可能通過某種機制抵抗熱應激對心肌的損傷[20]。心肌細胞內Hsp70水平隨時間的變化與仲慶振等人的研究相一致[10]。提示，Hsp無法長期穩定的高表達也可能是持續熱應激導致心肌凋亡的重要原因。
5 如何提高心肌細胞對熱應激的抵抗能力
由于熱應激對心肌細胞的損傷與動物機體其他組織細胞的損傷有一定的相關性，如熱應激會增加機體ROS的含量，高濃度的ROS會誘導細胞的凋亡[16]。熱應激作為非特異性應激反應，對動物機體的其他器官同樣會造成嚴重的傷害。所以，提高心肌細胞對熱應激的抵抗通常從動物整體水平上降低熱應激的損傷。例如，通過降低環境溫度來加快動物機體的散熱;飼喂具有抗氧化作用的中藥復方可顯著降低動物血清中的ROS等。
我國學者曾通過對中草藥的研究，尋求抗熱應激的方法，并且取得了一定的效果。例如近年來發現水母雪蓮可以顯著降低熱應激作用下的小鼠血清中心肌損傷標準物CK、LDH等的含量，從而減輕了熱應激對小鼠心肌細胞的傷害[21]。
抗氧化劑可以清除機體內的ROS，從而達到抗熱應激的目的，如維生素E、硒等。有學者發現維生素E可以通過增加心肌細胞內的金屬硫蛋白的表達，從而實現抵抗熱應激而保護心肌細胞目的[22]。近年來，在心肌組織中發現牛磺酸的含量非常豐富。牛磺酸具有清除ROS，降低血清中CK、LDH等心肌損傷標志物，抑制心肌細胞凋亡的作用[23]，并且可直接作為飼料添加物而受到廣泛關注。2000年發現的血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)可以水解Ang Ⅱ[24]，從而保護心肌細胞免受Ang Ⅱ引起的細胞凋亡。
6 小結
綜合近年來熱應激對動物心肌細胞的影響研究可知，心臟很容易遭受到熱應激的損傷。雖然心肌細胞可以通過合成Hsp進行短暫的抵抗，但長時間的熱應激仍然可以給心肌細胞帶來嚴重的傷害，甚至造成心肌細胞的凋亡。在動物飼養過程中，提高動物抵抗熱應激的重要一環就是提高動物心肌對熱應激的抵抗。但無論是在飼養條件方面，還是在營養水平上，都應盡量避免熱應激的發生。從機體整體水平上減輕熱應激損傷的同時，還應積極探討熱應激對心臟損傷的具體機制，尋找改善和提高心肌細胞抵抗熱應激能力的方法。
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動物醫學論文范文 第3篇
題目：探討生態環境與動物醫學
摘要：生態環境對動物生命活動及其致病因素的影響十分巨大而深遠;動物的生命活動及其致病因素對生態環境影響直接而明顯;兩者相互關聯、相互影響、相互作用、互為一個整體。因此動物醫學應將生態環境從宏觀上作為重要的研究對象，并在實踐中采取綜合措施才能既有效地控制疫病、又能保證生態環境。研究和應用生態環境與動物醫學之間的關系，具有很重要的作用和意義。
關鍵詞：生態環境 動物醫學 應用
動物實驗在醫學研究中有著重要的意義，是醫學研究中的重要方法。動物實驗過程的運行管理，對于動物實驗的 效果及科研成果尤其重要。我們做了100只家兔耳緣靜脈的留置針輸液實驗，實驗過程順利，取得滿意效果。現將其經驗及做法總結如下。
一、動物的選擇
1.動物來源確定 動物來源要選擇國家、省相關部門確定的醫學動物實驗室，其中包括《實驗動物管理條件》、《醫學實驗動物管理實施細則》的規定并取得醫學動物實驗條件的合格證明書。 其要求實驗動物的同種屬、同品系、同月齡、性別雌雄比例。
2 .熟悉并了解實驗動物 在實驗前，準備階段要到相應動物實驗室對參加實驗的動物進行初步的觀察、了解，主要觀察其生活習性、了解飼養要求等，重點掌握實驗的組織、器官等生理解剖部位、特點、并作初步評估。
二、預實驗
預實驗是對研究技術、方法的訓練，對設計方案的實踐評估，同時可以了解實驗動物對各種處理因素的反應情況，以及在試驗過程中，動物在生理、精神狀態、飼養等方面可能出現的一些問題作以了解，以便在正式實驗過程中作好提前的預防、分析，保證實驗過程的順利實施。
三、實驗效果
動物實驗要消耗一定的人力、物力、財力，所以對整個實驗過程必須周密布置，諸如以上各項做法，盡最大限度地保 障動物實驗的質量。以達到預期的目的。
四、討論與分析
動物實驗盡管有一定的不足，但在人體實驗之前，動物實驗是很重要的醫學研究方法，因此，從事醫療科研人員應該更多熟悉、了解和掌握有關動物實驗的基本知識和技巧，為臨床科研工作做好基礎。例如：
1.生態環境對動物生命活動及致病因素的影響作用
生態環境對動物種群結構的影響。不同地區、不同的生態環境，由于物種進化的直接原因導致了動物種群結構的不同。最直接的例子是農區與牧區從家畜家禽的品種、數量及生產性能上就明顯不同。僅以牛為例，西部主要是牦牛及揙牛、中東部主要是黃牛而南方多為水牛。生態環境對動物種群結構的影響主要是受自然因素的制約。如不同的氣溫、海拔、日照、濕度、植物結構、降水、河流分布等等直接選擇并影響了動物的品種。人們的生產生活對動物及其生命活動的選擇也深刻地影響了動物種群結構。不同族群、不同的生活習俗、不同的信仰、不同的生產生活方式深刻地選擇了動物的進化方向和動物的種群結構。如牦牛和麋鹿的飼養就體現了這種選擇的影響。
生態環境對動物生命活動的影響。生態環境特別是自然環境影響著動物生命活動的每一個環節。我國西北牧區畜群的一個典型現象——“夏飽、秋肥、冬瘦、春死亡”就是這一影響的結果;我國的黃牛從東南到西北，從低海拔到高海拔，從平原到山區其產肉性能、泌乳性能及皮毛肉乳產品的質量差異也主要是這一影響的結果。人們的生產生活及需要直接干預了動物的整個生命活動。人們為了自身的需要直接干預動物的生命活動過程，其影響持續而且巨大。漢唐初期國家為了戰爭需要，全國大規模飼養戰馬;改革開放以來，大量引進國外奶牛、生豬及家禽，使我國本地畜禽品種數量銳減甚至個別消失;為了提高產量，人們大量采用人工授精技術、采用規模化養殖方式等等技術，使動物的每一個生命活動都受到人為的干預，其影響和結果差異十分明顯。
2.動物生命活動及病源微生物對生態環境及人們生產生活的影響
動物生命活動對生態環境的影響。生物鏈對生態環境的影響十分明顯，進化論及生態學都證明了生物鏈中任何一環的失衡對生態環境的影響都十分巨大。例如物種之間的競爭、物種內部的競爭都直接影響著生態環境。動物的個體生命活動、群體生命活動對生態環境的影響和作用相當深刻。例如動物的季節性遷徒、動物的排污，特別是動物的疾病、死亡及尸體對生態環境的影響與作用是直接而明顯的。
病源微生物對生態環境及人們生產活動的影響。長期以來，人們一直把致病因素作為負面的對象進行研究，其實致病因素特別是病源微生物本身就是生態環境中最基本的一環，是微生態環境中最重要的一環。動物疾病的發生從本質上講是致病因素在生態環境中從微觀到宏觀的水平上失衡導致的。因此動物致病因素深刻而且巨大地影響著生態環境中動物的生命活動，使其個體、群體在微觀和宏觀水平上失衡。利用病源微生物在生態環境中的作用可以深刻地影響人類活動。人們利用牛痘預防天花，現在人類已消滅了天花;青霉素的生產和使用挽救了無數人的生命，但現在的濫用又給人類和環境造成了巨大的危害。
總之，由此可以看出生態環境與動物的生命活動及致病因素之間是相互聯系、相互作用、相互影響的一個有機的統一整體。傳統動物醫學的目的是控制并治療好疾病，而研究和利用動物環境醫學的目的是怎樣不讓動物及其群體生病或盡可能少地生病，因此研究和利用動物環境醫學具有深遠的作用和意義。所以動物醫學在研究對象上應該從宏觀角度把生態環境作為一個整體來進行，才能準確地把握疾病的發生、發展及流行方式，才能綜合采取措施，做到既能防控病癥，又能保證生態環境，只有這樣才能使畜牧業健康持續科學地發展，而不是一味地追求畜牧經濟存量及利益的最大化。因此研究和應用生態環境與動物醫學之間的關系以指導畜牧業生產、約束人們的生產生活方式、達到最佳的疾病防控目的，具有極其重要的意義和作用。
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動物醫學論文范文 第4篇
題目：牛病毒性腹瀉病毒檢測方法研究進展
牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的以高熱、腹瀉、懷孕母牛流產或胎兒畸形、口腔和消化道黏膜糜爛、壞死及血小板和白細胞減少為主要特征的接觸性傳染病[1]。BVDV的自然宿主是牛，感染懷孕牛后，可導致持續性感染(persistent infection，PI)牛犢的出生，PI牛在整個生存周期持續排出大量感染性病毒顆粒，是易感動物感染病毒的主要來源。目前BVD呈全球性分布，給各國的養牛業造成了嚴重的經濟損失，急性感染的病牛導致的損失達每頭牛46.5美元[2]。
BVDV包括BVDV-1、BVDV-2兩種基因型，每種基因型都包括致細胞病變型(cytopathic，CP)和非致細胞病變型(non-cytopathic,NCP)兩種生物型。根據5’-UTR、Npro和E2基因序列的差異，將BVDV-1分為至少22個基因亞型，將BVDV-2分為4個基因亞型。BVDV在我國各個省份均有流行，且流行形勢較為復雜，新疆、云南等地部分牛場的BVDV陽性率達60%以上[3-4]。有些地區牛群中甚至同時流行多種亞型[5]。當前，BVDV的防控主要依靠疫苗免疫及清除PI牛，而如何準確對BVDV感染牛及PI牛進行鑒別診斷顯得尤為重要。本文綜述了國內外BVDV檢測方法的研究進展，以期為BVD的防控和凈化提供參考。
1 病原學診斷
1.1 病毒的分離鑒定
各種牛源細胞均可用于BVDV的分離培養，目前最常用的是傳代牛腎(MDBK)細胞。將病毒分離材料，如牛血清樣本、分泌物、排泄物等經過處理后接種MDBK細胞，如是致細胞病變型毒株，可在接種細胞后的最初幾代內出現皺縮、變圓、拉網、脫落，聚集后產生合胞體和巨細胞等現象即可初步確定為BVDV。而非致細胞病變型毒株，則需盲傳3代～5代，最終結合免疫熒光等方法確定病毒分離成功。BVDV的分離鑒定是最基礎的檢測BVDV的技術，是鑒別BVDV感染的“金標準”，該項技術不需要特殊的儀器設備，僅進行細胞培養即可。但該方法操作周期較長，不能滿足BVDV快速檢測的需求，且不適用于大量樣本的檢測。此外，該項技術對細胞、血清的要求較高，特別是近些年作為細胞分離培養原材料之一的胎牛血清中BVDV污染較為嚴重，較大程度限制了該方法的使用。目前有研究人員使用異源血清進行分離培養[6]。
1.2 電鏡檢查
電鏡檢查是觀察BVDV顆粒的經典方法，常用的有直接電鏡技術和免疫電鏡技術。直接電鏡技術對BVDV樣本的量要求較高(約107個/mL)，觀察到的BVDV顆粒通常是散在的，但可觀察到病毒粒子的自然形態。李禎等[6]在透射電鏡下觀察到直徑為40 nm～60nm的球形、外被囊膜的BVDV顆粒。而免疫電鏡技術通常可見到大量的BVDV顆粒聚集在一起。王冶才等[7]利用免疫電鏡技術，觀察到大小不等的BVDV粒子。相較于直接電鏡技術，免疫電鏡技術敏感性更好，且可更快速地觀察到病毒粒子。近些年又發展出檢測BVDV的蛋白A膠體金免疫電鏡技術，相較于傳統的直接電鏡技術和免疫電鏡技術，該技術敏感性更高，更快速。但不管是哪種電鏡技術，均需專業人員使用專業的儀器設備進行操作，檢測成本較高，且檢測時間較長，僅適用于初篩為BVDV陽性樣本的確認，該方法只能用于BVDV的實驗室檢測，無法推廣到基層。
2 血清學方法
2.1 血清中和試驗
血清中和試驗是對BVDV或抗體進行定性或定量分析的一種方法，在實際操作中，可對疑似感染牛間隔3周～4周前后采血2次，測定血清的中和抗體效價，如果第2次高于第1次4個滴度以上可判為陽性，2個滴度以上，視為疑似患病。該方法敏感性高、特異性好、可重復性強，是世界動物衛生組織(WOAH)推薦的檢測BVDV抗體的標準方法之一，廣泛用于BVDV的血清學調查。但在檢測抗體時，因BVDV不同基因型及基因亞型的抗原性存在差異，抗原的選擇會對抗體滴度的精確定量存在影響[8]，且由于持續性感染牛對病毒缺乏免疫應答而不產生抗體，在進行血清中和試驗時會因為陰性結果而造成誤判。此外，該方法操作較為繁瑣，周期長，費時費力，目前僅用于BVDV的實驗室檢測。
2.2 酶聯免疫吸附試驗
目前檢測BVDV的常用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、阻斷ELISA、斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)、葡萄球菌A蛋白的酶聯免疫吸附試驗(PPA-ELISA)、單層酶聯免疫吸附試驗(M-ELISA)及細胞內酶聯免疫吸附試驗(In Cell-ELISA)等。
2.2.1 間接酶聯免疫吸附試驗 間接酶聯免疫吸附試驗是檢測BVDV抗體的常用方法，可用于檢測樣品中BVDV總抗體的濃度。但采用全病毒作為包被抗原需對BVDV大量增殖后進行濃縮和純化，難度較高。為彌補這一缺點，可采用重組蛋白作為包被抗原，其中結構蛋白Erns和E2及非結構蛋白p80因免疫原性較強，常作為包被抗原。陳瑞紅[9]將3種蛋白分別進行原核表達并建立ELISA方法，通過比較，認為重組蛋白E2作為包被抗原建立的間接ELISA方法更為特異。
2.2.2 雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗 捕獲抗體和檢測抗體一般由不同種屬的動物制備，如應用單克隆抗體，一般選擇2個針對BVDV不同抗原決定簇的單克隆抗體。胡俊英等[10]制備了抗BVDV E2蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，并以此建立了基于單克隆抗體捕獲BVDV抗原的雙抗體夾心ELISA方法，動物感染病毒后可通過檢測其糞便排泄物的BVDV抗原作出早期診斷。丁金華[11]與周子恒[12]分別利用納米抗體和多克隆抗體建立基于抗BVDV納米抗體雙抗體夾心ELISA檢測方法，用于檢測BVDV，雖然方法在敏感性方面存在問題，檢測效果不理想，但將納米抗體引入ELISA方法的建立過程，仍為BVDV檢測方法的改進提供了新思路。
2.2.3 阻斷酶聯免疫吸附試驗 阻斷酶聯免疫吸附試驗也稱競爭ELISA，當待檢樣品無法提純或不能進行稀釋時，可用此法檢測BVDV特異性抗體。王新平等[13]建立了雙抗體夾心阻斷ELISA方法，并對長春地區293頭奶牛和262頭黃牛的血清樣品進行測定，結果顯示,黃牛抗體陽性率高達43.5%。但阻斷ELISA的缺點是操作較為繁瑣，用時較長。
2.2.4 斑點酶聯免疫吸附試驗 斑點酶聯免疫吸附試驗是一種經濟、快捷，可肉眼直接判定的ELISA方法，適合BVDV的臨床診斷及抗體監測。Zhao Y L等[14]建立了檢測BVDV抗體的間接Dot-ELISA，與Idexx ELISA試劑盒相比，該方法的特異性、敏感性和準確性分別為96.7%、92.5%和95%。
2.2.5 葡萄球菌A蛋白的酶聯免疫吸附試驗 葡萄球菌A蛋白的酶聯免疫吸附試驗是利用辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌A蛋白代替酶標二抗建立的ELISA方法，其優點是可用于多種哺乳動物抗體的檢測。柴順秀等[15]利用BVDV重組E2蛋白建立了檢測BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法，結果顯示與Idexx ELISA試劑盒的檢出率無顯著差異。
2.2.6 單層酶聯免疫吸附試驗及In Cell酶聯免疫吸附試驗 單層酶聯免疫吸附試驗是將細胞培養與ELISA結合的檢測技術。研究人員通過比較發現，檢測BVDV時，M-ELISA與病毒分離試驗敏感性無顯著性差異，但比免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)方法更快速，且更客觀。In Cell-ELISA是一種用于檢測和分析BVDV感染的新方法，將BVDV的傳染性標準化為培養細胞的數量，可用于CP和NCP毒株的檢測[16]。ELISA方法是目前檢測BVDV應用最廣泛的方法之一，與經典的病毒分離等方法相比，該方法可同時對批量樣本進行檢測，且對儀器設備和試驗人員的要求較低。但利用ELISA方法進行BVDV抗體檢測時，容易受到母源抗體的干擾，且與同屬的豬瘟病毒(Classical swine fever viru，CSFV)之間存在交叉反應，也不能對PI牛進行篩選。
2.3 免疫熒光技術
檢測BVDV常用的方法有直接免疫熒光技術和間接免疫熒光技術。直接免疫熒光技術即將熒光素標記在抗體上，直接與BVDV抗原發生反應。優點是簡便快捷，特異性高，非特異性染色少，缺點是敏感性低，且標記的抗體需達到一定濃度，否則熒光太弱，影響結果的觀察。此外，有研究表明BVDV基因型及抗原差異對直接免疫熒光試驗影響較大[17]。間接免疫熒光方法較直接免疫熒光方法敏感性提高，該方法與血清中和試驗、病毒分離試驗的結果高度相關，且敏感性高于抗原捕獲ELISA，更適合用于血清中BVDV抗原的檢測[18-20]，但其缺點是容易產生非特異性熒光。不管是直接方法還是間接方法，都需要使用熒光顯微鏡，對儀器設備的要求較高，一般僅用于BVDV的實驗室檢測，無法用于基層檢驗。
2.4 瓊脂擴散試驗
瓊脂擴散試驗靈敏度不高，與微量中和試驗的陽性率之間差異極顯著(P<0.01)[21]，且僅能檢測出BVDV群特異性抗體，與CSFV存在交叉反應。不能用于BVD的精確診斷，盡管如此，因瓊脂擴散試驗操作簡便，無需特殊的設備或試劑，可用于大量血清樣本的檢測，常作為基層BVDV檢測的初篩方法。
3 分子生物學方法
3.1 核酸擴增
3.1.1 RT-PCR 目前已廣泛用于BVDV的鑒定、分型及遺傳進化分析，對CP型和NCP型毒株均可檢測，該方法特異性高、敏感性強、檢測周期短，能批量檢測臨床樣本，且多次檢測時可篩選出群體中的持續性感染動物[22]，對于BVDV的防控具有重要意義。隨后，在普通PCR的基礎上，研究人員又建立了套式RT-PCR及可同時檢測BVDV與常見牛腹瀉疾病的雙重或多重RT-PCR方法，檢測靈敏度高于普通PCR[23]，且大大提高了檢測效率，降低了檢測成本。但普通RT-PCR只能定性分析，需通過瓊脂糖凝膠電泳判定結果，在操作過程中常因氣溶膠污染出現假陽性，且存在非特異性條帶時容易產生誤判。因此，在操作時應嚴格設置陰陽性對照，保障結果的準確性。雖然該方法應用廣泛，但因需要PCR儀，尚無法推廣到基層進行使用。
3.1.2 熒光定量RT-PCR 在普通RT-PCR基礎上，研究人員建立了檢測BVDV的熒光定量RT-PCR方法，敏感性顯著高于RT-PCR[24]，且能定量分析待檢樣品。加入反應體系后不必打開反應管，一定程度上避免了氣溶膠污染。但該方法需要熒光定量PCR儀，儀器的使用和維護成本較高，試劑和耗材也高于普通PCR儀，僅可用于BVDV的實驗室檢測。
3.1.3 RT-LAMP 近年來，隨著環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的發展，研究人員建立了可用于BVDV檢測的RT-LAMP檢測方法，該方法雖然與病毒分離方法的陽性率差異較大，但與Idexx抗原捕獲ELISA方法的陽性率無明顯差異[25]，且從試驗設計復雜程度、擴增反應效率、使用儀器簡單程度及檢測成本等方面均優于熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR[26]，更適合用于基層BVDV的快速檢測。范晴等[27]在RT-LAMP的基礎上，在LAMP引物中標記熒光基團，建立了二重熒光RT-LAMP，反應后通過擴增產物的顏色讀取反應結果，可準確鑒別檢測BVDV和牛輪狀病毒(Bovine rotavirus,BRV)兩種病毒，解決了國內多重LAMP方法不能準確檢測是哪種病原而引起陽性結果的問題。
3.1.4 納米PCR 納米PCR是一種新型的PCR技術，敏感性高于常規PCR，可用于BVDV的快速檢測。劉澤余等[28]利用該技術對吉林省部分省界地區的血清樣品及臨床組織病料進行檢測，共檢測出150份陽性血清樣品，BVDV陽性率為19.21%。
3.1.5 重組聚合酶擴增-側向試紙條檢測 該技術簡稱為RPA-LFD。重組酶聚合酶擴增(recombinant polymerase amplification,RPA)被認為是可以替代PCR的核酸檢測技術，侯佩莉等[29]針對BVDV 5’UTR序列，建立了一種BVDV RPA-LFD檢測方法，檢測限達2TCID50，與WOAH推薦的實時熒光PCR方法檢測限一致。
3.2 核酸探針雜交技術
3.2.1 核酸探針雜交技術 廣泛應用于病毒或細菌的基因檢測。根據標記物的不同，一般將核酸探針分為兩類：一類是放射性同位素標記探針(如32P等)，一類是非放射性物質標記核酸探針(如生物素、地高辛等)。因放射性同位素具有放射危害且半衰期短、不穩定，目前BVDV的檢測常用的是非放射性物質標記核酸探針。雜交試驗可以檢測CP型和NCP型毒株，且敏感性比BVDV感染試驗強10倍～100倍[30]。值得注意的是，針對BVDV基因組不同區域的探針，檢測率存在差異，針對5’末端的探針檢出率高于其他區域[31-32]。隨著納米技術的發展，Heidari Z等[33]建立了交聯與非交聯金納米雜交試驗，可直接檢測BVDV，無需擴增，檢測靈敏度可達每反應6.83 ng和44.36 ng，兩種方法成本低廉，操作簡單，可用于BVDV臨床樣本的檢測。核酸探針雜交技術操作簡便、特異性高、敏感性強，結果準確，可在同一張膜上進行幾個甚至上百個樣品的檢測，可用于BVDV大量樣本的快速檢測，但單個樣品的檢測成本較高。
3.2.2 基因芯片技術 基因芯片技術是分子雜交技術的發展，與傳統的核酸分子雜交技術相比，該方法可實現樣品的高通量檢測，并能同時檢測多種病原，由于該方法的反應體積小，大大降低了檢測成本，能用于BVDV大規模的檢測篩選。隨后，高峰等[34]將LAMP技術與微流控芯片技術有機結合，可同時檢測包括BVDV在內的5種病原，為口岸檢疫探索出一種快速、高通量檢測動物疫病的方法。而魏春霞等[35]建立了一種可視化基因芯片檢測方法，具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點，可在3 h內完成同時對包括BVDV在內的7種牛重要疫病病原的檢測，在牛群疫病診斷、凈化及流行病學調查等方面具有良好的應用前景。
4 結語
BVDV是影響全球養牛業的主要動物疫病病原之一，在我國感染范圍廣泛，且具有遺傳多樣性。準確鑒別檢測BVDV，以了解該病在我國的流行現狀及主要流行毒株，同時篩查并清除PI牛，為我國BVD的防控及凈化提供理論依據及技術支持。目前，診斷BVD的方法很多，每種方法都有適用性，也有局限性，應根據檢測目的的差異，選擇不同的方法，如牛場臨床樣本的初篩可選擇瓊脂擴散試驗、ELISA試驗及RT-PCR;出入境口岸可選擇基因芯片技術、多重熒光定量RT-PCR等高通量檢測方法，可快速檢測多種病原;對于可疑樣本可選擇病毒分離培養、免疫熒光及電鏡檢查等方法進行最終確定，并利用RT-PCR進行遺傳進化分析。實際工作中，往往選擇幾種檢測方法對同一樣本進行檢測，以避免假陽性或非特異性結果的出現。隨著分子生物學技術的不斷發展，相信會有越來越多更加敏感、特異、快速的檢測方法的建立，為BVDV的精準防控奠定基礎。
動物醫學論文范文 第5篇
題目：高壓氧在治療犬和貓腎衰竭中的應用
慢性腎功能衰竭是在發生各種慢性腎臟疾病基礎上，由于腎單位逐漸受損，緩慢發展的腎功能減退以致不可逆轉的腎衰竭。該病主要表現為腎功能減退，代謝廢物(尤其是蛋白分解后的含氮代謝產物)潴溜，水、電解質和酸堿平衡失調，與腎臟有關的多種內分泌功能失調，以至于不能維持機體內環境的穩定而引發的臨床綜合征。慢性腎衰竭是犬和貓最常見腎臟疾病，是犬的第三大致死因素，貓的第二大致死因素，最常發生在5歲以上的犬和貓。高壓氧治療(hyperbaric oxygen therapy，HBOT)是在超過一個大氣壓的氧艙中呼吸純氧氣以達到治療目的治療方式。本文主要介紹臨床接診的30例腎衰竭病例，通過常規輸液治療配合高壓氧治療前后相關指標的變化情況。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物 來我院就診的30例臨床腎衰竭，其中犬15例，貓15例。年齡最小2歲，最大12歲。
1.1.2 主要儀器 高壓氧艙，上海寶邦醫療器械有限公司產品;血氣分析儀，雷度米特醫療設備有限公司產品;獸用全自動血液細胞分析儀，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司產品;VET Chroma(維克瑪)熒光免疫分析儀，韓國 ANIVET公司產品;全自動生化分析儀，天津微納芯科技有限公司產品。
1.2 方法
1.2.1 一般檢查 精神沉郁，活動力差，體況差(體況評分均小于4/9)。可視黏膜粉紅色，口臭，有牙齦炎及牙結石，毛細血管再充盈時間大于2 s，均出現不同程度脫水，皮膚被毛干燥，觸診淺表淋巴結正常。
1.2.2 實驗室檢查 包括血常規檢查，急性反應蛋白C反應蛋白(淀粉樣蛋白)，血液生化，血氣等。
1.2.3 治療 對上述病例進行治療，治療主要包括常規治療和高壓氧治療。常規治療主要是根據個體情況進行抗菌消炎，補充能量，糾正水、電解質、酸堿平衡以及其他對癥治療。而高壓氧治療則按照每次高壓氧1 h，每日1次，5次為一療程，治療最短1個療程，最長4個療程。15只貓和15條犬分別在1個療程后進行相關血液項目檢測。
2 結果
患病動物治療前血常規檢測結果顯示，血液白細胞數升高及紅細胞數降低。C反應蛋白(淀粉樣蛋白)含量均出現升高，最高為257.79 mg/L(正常指標<10 mg/L)。治療后白細胞數及紅細胞數趨于正常，C反應蛋白(淀粉樣蛋白)含量出現不同程度的降低。
15只貓和15條犬治療前后血液生化和血氣結果見表1和表2。治療后腎臟指標均出現不同程度的降低，血氣檢測體內酸中毒轉歸甚至消失，取得了較為滿意的治療效果。在治療過程中，8例死亡，15例指標恢復正常，7例繼續堅持高壓氧治療。
表1 治療前后部分生化腎功指標對比
表2 治療前后血氣主要指標對比
3 診療體會
高壓氧治療在人醫上應用時間比較長，近幾年才開始進入動物診療。關于高壓氧在動物治療應用方面的文獻報道比較少，之前有報道的也是高壓氧在脊髓損傷、肺損傷、傷口愈合等方面的文獻[1-5]。
人醫上關于高壓氧治療腎臟疾病的研究比較早[6-7]。Ivanov M等[8]及商昌歡等[9]發現高壓氧對腎臟的缺血再灌注損傷有保護作用。其機制主要是通過增加血液中氧的物理溶解量，提高組織氧分壓，以糾正機體缺氧或促進細胞有氧代謝，從而改善缺血組織的灌注情況、促進損傷組織的恢復。從分子生物學研究發現高壓氧可以減少腎小管上皮壞死細胞凋亡，從而發揮保護腎臟的作用[10-14]。陳北方等[15]研究發現高壓氧可以增加血液和尿液中的SOD(腎臟抗氧化酶的一種)水平，從另一個方面解釋高壓氧治療慢性腎功能衰竭的可能機制。
在臨床治療犬和貓急慢性腎衰時，HBOT是首推的輔助治療方法之一。高壓氧治療使得腎功指標和血氣指標改善的可能機制是HBOT時腎血流減少，腎小球濾過率增加，有助于代謝廢物的清除和電解質及酸堿平衡的維持;增強機體抗氧化能力，減少組織的氧化損傷;有利于修復和新生血管的生發，有利于腎臟局部微循環的重建及其功能的恢復。HBOT環境下使機體處于富氧狀態，能有效緩解缺血再灌注對腎臟的損傷，能促進機體的新陳代謝，對腎臟新生血管的生發和組織修復存在多方位的保護作用，有助于急慢性腎病的治療和轉歸。高壓氧與常規治療結合，加速病患愈合轉歸，起到事半功倍的效果。
動物醫學論文范文 第6篇
題目：抗雞球蟲病基因重組疫苗的研究進展
雞球蟲病(Avian coccidiosis)是由頂復門(Apicomplexa)孢子綱(Sporozoasida)艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲引起雞的一種腸道原蟲病，球蟲主要寄生于雞的腸上皮細胞內，初次在禽類腸道發現距今已有100多年歷史，其對雞的危害十分嚴重。雞球蟲病在世界各地均有發生每年造成的全球經濟損失超過35億美元[1]。雞感染球蟲后會表現出血性、壞死性腸炎和血痢等癥狀[2]。同時，球蟲的亞臨床感染也十分常見，多影響食物轉化率、平均日增重和出欄時間等關鍵生產參數。
目前雞球蟲病的防控主要依賴化學抗球蟲藥、活卵囊疫苗和飼養管理等策略。隨著抗雞球蟲病藥物的大量使用，耐藥蟲株日漸增多，藥物殘留等弊端也日益明顯，大大限制了抗雞球蟲病藥物的應用[3]。免疫預防在后抗生素時代逐漸成為控制雞球蟲病的替代方法。目前的抗雞球蟲病疫苗主要以強毒或減毒活卵囊疫苗為主，但二者都存在一定的缺陷[4]，強毒活卵囊疫苗不適當的使用可能會導致球蟲病暴發或將新的強毒球蟲蟲株引入養殖場，而弱毒活卵囊疫苗存在毒力返強的風險;此外，所有活卵囊疫苗的應用都屬于感染性免疫，存在影響免疫雞體腸道健康的潛在危機。因此，新一代安全高效的球蟲防控策略亟待改善。
隨著各種基因工程技術的發展，疫苗研究的方向正逐漸從傳統滅活苗和弱毒苗向基因工程疫苗過渡。目前正在研發或已應用于生產實踐的基因重組疫苗主要包括核酸疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和合成肽疫苗等[5]。與傳統疫苗相比，基因重組疫苗具有安全、穩定、高效、易于制備等特點。在本綜述中，總結了現有的抗雞球蟲病措施，探索了可用于重組抗雞球蟲病疫苗的候選方案。
1 當前抗雞球蟲病主要措施
1.1 抗雞球蟲病藥物
大量研究表明，藥物仍是防治球蟲病的主要措施與手段。當前抗雞球蟲病藥物(表1)包括聚醚類離子載體抗生素、化學合成藥[3]及中草藥。
表1 常用抗球蟲藥
聚醚類離子載體抗生素由放線菌(Actinomaduraspp.)或鏈霉菌(Streptomycesspp.)發酵產生，主要作用于球蟲無性繁殖與有性繁殖階段，通過干擾球蟲細胞內陽離子的正常交換，破壞細胞內外滲透壓，致使細胞死亡。由于其具有廣譜抗雞球蟲病作用，被廣泛應用于養雞業。
化學合成類抗雞球蟲病藥主要通過抑制球蟲線粒體呼吸作用、干擾球蟲二氫葉酸的合成或競爭性抑制硫胺攝取等方式來阻滯球蟲的正常發育。
近年來，球蟲對聚醚類抗生素和化學藥物的耐藥愈發普遍。研究發現，我國各地的柔嫩艾美耳球蟲對聚醚離子載體類抗生素和化學抗雞球蟲病藥物呈現不同程度的耐藥性[6]。黃儀娟[7]等通過對分離得到的6株雞艾美耳球蟲蟲株進行耐藥性試驗，發現6株蟲株均呈現中度或重度耐藥。
盡管抗雞球蟲病藥物在雞球蟲病的防控中發揮著巨大作用，但不可避免的耐藥性問題以及當前全面減抗替抗背景下對抗雞球蟲病藥物使用的限制，消費者對食品中化學殘留物的擔憂，阻礙了大多數抗雞球蟲病新藥的開發。
1.2 活卵囊疫苗
艾美耳球蟲活卵囊疫苗由未減毒或減毒的艾美耳球蟲蟲株研制而成，可以有效替代化學藥物用于預防雞球蟲病，雞在攝入和循環受控劑量的疫苗卵囊后，可以獲得堅強的免疫保護[8]。由于疫苗株的生產需要通過在雞中獨立傳代多次，抗雞球蟲病疫苗在家禽業的應用受到了很大限制。對于生產能力的高要求，也意味著疫苗成本遠高于抗雞球蟲病藥[5]。
活卵囊疫苗也存在一定的缺陷。接種疫苗有引入新蟲株的風險;活卵囊會引起雞輕微腸道病變，影響飼料轉化率;由于球蟲卵囊較大，易沉積，添加懸浮劑后若不混勻，極易造成免疫不均，影響免疫效果。在免疫期間禁止使用抗球蟲藥，飼料中也不能含有抗球蟲藥物。以上因素的存在限制了球蟲疫苗在養殖戶中的廣泛應用。
1.3 基因重組疫苗
基因重組疫苗主要有核酸疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗等 。核酸疫苗是將含有編碼抗原基因序列的質粒載體，通過肌肉注射或用基因槍等導入宿主體內，被宿主的組織細胞、抗原呈遞細胞或其他炎性細胞攝取，抗原蛋白在宿主細胞內表達，誘導產生特異性免疫應答，從而達到防治疾病的目的[9]。亞單位疫苗是通過基因重組技術，調取病原微生物保護性抗原基因并導入表達系統，在其高效表達后提取保護性抗原，加入佐劑制成的重組亞單位疫苗[10]。CoxAbic是第一個商業化的球蟲病亞單位疫苗。由從巨型艾美耳球蟲(E.maxima)分離到的親和純化的配子母細胞抗原(affinity purified sexual stage (gametocyte) antigens,APGA)組成[11]。接種蛋雞后其抗球蟲作用可通過蛋垂直傳播給下一代。活載體疫苗主要是利用分子生物學手段，將目的抗原的編碼基因導入細菌或病毒活載體，隨著重組菌(毒)株在宿主體內增殖，目的基因大量表達，從而誘發相應的免疫保護應答[12]。自20世紀80年代有關于重組疫苗開發的報道以來，多個研究小組已經嘗試和試驗了多種候選抗原。據報道，在免疫球蟲抗原重組蛋白、重組球蟲抗原DNA疫苗及聯合病毒活載體的球蟲抗原疫苗的小規模試驗中，球蟲卵囊計數或腸道損傷評分降低了30%～90%，或者在飼料轉化率或相對增重率方面得到了改善[13]。
2 抗雞球蟲病基因重組疫苗研究進展
當前抗雞球蟲病基因重組疫苗的研究主要集中于抗原蛋白的選擇與細胞因子佐劑的聯合使用。同時，艾美耳球蟲復雜的抗原多樣性對基因重組疫苗的研制造成了一定的阻礙，選擇合適的抗原是開發新型基因重組疫苗的關鍵。
2.1 候選抗原蛋白分子研究進展
在宿主與蟲體互作中發揮重要作用的蛋白被確定為抗雞球蟲病疫苗候選蛋白，這是由于這些蛋白在球蟲入侵與增殖過程中自然暴露，因此可以作為宿主免疫應答的靶標[10]。
研究最廣泛的是微線體蛋白，微線體位于頂復門寄生蟲頂端，可分泌頂膜抗原(apical membrane antigen,AMAs)、微線體蛋白(microneme proteins,MICs)等，對寄生蟲的滑行運動與黏附宿主細胞以及進出受感染細胞至關重要[14]。MICs在入侵早期分泌，幫助寄生蟲附著于宿主細胞，為入侵創造平臺[15]。對柔嫩艾美耳球蟲的蛋白質組進行分析，發現AMAs蛋白在子孢子階段和裂殖子階段均存在。研究發現AMA1是子孢子入侵宿主的關鍵蛋白，是形成蟲體與宿主細胞間環形運動結合體(moving junction,MJ)不可缺少的一部分[16]。
SO7蛋白又稱RB1或GX3262，位于子孢子折光體上，作為重組蛋白、核酸疫苗或以鼠傷寒沙門氏菌為載體時，可誘導部分保護性免疫。研究發現柔嫩艾美耳蟲重組折光體蛋白EtSO7能有效誘導免疫雞產生細胞和體液免疫反應，對盲腸感染球蟲的雞有明顯的保護作用[17]。
TA4蛋白位于柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面，研究發現抗TA4抗原的單克隆抗體會對雞球蟲子孢子入侵細胞產生抑制作用，表明TA4抗原可能在球蟲入侵宿主細胞過程中發揮重要作用[18]。近年來大量研究也證實，以 TA4 基因編碼的蛋白免疫雞只，能夠收到良好的抗球蟲效果。IMP1定位于子孢子細胞膜，現已作為候選抗原被廣泛研究。近年來，IMP1蛋白被先后確定為巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲的疫苗候選分子[19-20]。3-1E蛋白是研究最多的抗雞球蟲病亞單位疫苗抗原。其主要與肌動蛋白單體結合，延緩肌動蛋白聚合作用，同時也在弓形蟲的滑行運動中發揮重要作用。它還是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)5、11和12的配體，這些受體在許多胞內病原微生物(如弓形蟲)的免疫反應中發揮關鍵作用[21]，這表明3-1E蛋白可作為一種新的黏膜佐劑。研究發現免疫艾美耳球蟲3-1E蛋白增強了小鼠對急性靜脈病毒感染的抵抗力[22]。將艾美耳球蟲3-1E蛋白、產氣莢膜梭菌NetB蛋白與Montanide IMS佐劑聯合應用，在巨型艾美耳球蟲和產氣莢膜梭菌共感染動物試驗中，增強了對于壞死性腸炎的抵抗效果[23]。
乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)作為無氧糖酵解途徑的末端酶，對寄生蟲在宿主體內的生命活動有較大影響。研究表明，每種球蟲僅有一種LDH，因此常被用以鑒別艾美耳球蟲蟲種。分析柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)和堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)的LDH氨基酸序列，發現其同源性為66%～80%，且其蛋白表達水平在球蟲發育各階段無明顯差異，具有作為疫苗候選抗原的潛力[24]。
2.2 細胞因子佐劑研究進展
細胞因子具有廣泛的生物學活性，在調節固有免疫和獲得性免疫中發揮著關鍵作用，由抗原或其他刺激劑誘導多種細胞產生。大量研究表明將細胞因子作為佐劑與球蟲疫苗聯合使用，可以調節免疫細胞活性，增強疫苗的免疫保護力和機體的免疫水平。通過將球蟲保護性抗原與相應細胞因子連接構建表達載體，可以有效改善基因重組疫苗的缺點。
白介素(IL-2、IL- 12、IL-18)、干擾素(IFN-α、IFN-γ)和腫瘤生長因子(tumor growth factor,TGF)b4等被廣泛用作基因重組疫苗的佐劑。在加入IFN-α和淋巴細胞趨化因子后，感染堆型艾美耳球蟲雞的飼料轉化率得到了顯著提高，而IL-1β、IL-8、IL-15、IFN-γ、TGFb4和淋巴細胞趨化因子則可降低球蟲的復制。細胞因子的劑量和類型也會影響局部免疫反應的質量。研究表明，聯合注射pcDNA3.1-IL-2重組質粒對雞球蟲疫苗免疫具有增效作用[25]。近年來，IL-2被證實可與多種艾美耳球蟲抗原相結合，如TA4、SO7以及堆型艾美耳球蟲抗原cSZ-2，表明IL-2的聯合應用可增強基因重組疫苗誘導的免疫保護效果。
2.3 抗原多樣性
了解球蟲基因組遺傳多樣性的程度與研究其野外生存和進化能力高度相關。在外界選擇壓力的變化下，適應的速度對球蟲的生存至關重要，常受到遺傳多樣性的影響。Emily等[26]對248條來源于堆型、巨型和柔嫩艾美耳球蟲的ITS1-5.8S-ITS2序列的固定系數(FST)進行了比較，結果表明其存在顯著的種內多樣性，其中柔嫩艾美耳球蟲可能存在地域差異。艾美耳球蟲的遺傳多樣性和復雜的生命周期使基因重組疫苗的研制成為一項艱巨的任務[27]。
迄今為止，各界學者僅對少數艾美耳球蟲的候選疫苗抗原進行了詳細的序列分析以確定其多樣性。研究發現，當巨型艾美耳球蟲頂膜抗原EmAMA1作為DNA疫苗或細菌載體重組蛋白疫苗進行免疫時，可誘導強大的同源免疫保護作用[19]。此外，對來自中國、埃及、德國、印度、日本、利比亞、尼日利亞、英國、美國和委內瑞拉的56份柔嫩艾美耳球蟲現場樣本的EtAMA1編碼序列分析顯示，該樣本存在中度多態性，與柔嫩艾美耳球蟲的全基因組多樣性形成鮮明對比[28]，說明AMA1是一種良好的候選疫苗抗原。李靈娟[29]通過分析從毒害和堆型艾美耳球蟲中克隆到的NA4和3-1E抗原基因，發現NA4抗原與柔嫩艾美耳球蟲的TA4抗原之間基因序列的同源性達91.4%，氨基酸序列的同源性為86%;3-1E抗原在柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲之間的基因序列同源性達99.8%，氨基酸序列的同源性為99.4%，動物交叉免疫保護試驗證明兩種抗原對4種艾美耳球蟲均有部分交叉免疫保護作用，說明這2種抗原有可能作為艾美耳球蟲交叉免疫保護性DNA疫苗的候選抗原。
抗原多樣性會影響針對頂復門原蟲如惡性瘧原蟲的實驗性疫苗的效力。由抗原多樣性導致的免疫逃避在堆型、巨型、和緩以及柔嫩艾美耳球蟲中均有發現。因此，詳細了解編碼候選疫苗抗原的基因多樣性是選擇最優候選疫苗抗原的關鍵。
3 影響免疫效果的因素
3.1 免疫途徑
由于免疫途徑不同，參與免疫應答的效應細胞也不同，可能會對疫苗的免疫保護效果造成一定影響。免疫途徑的選擇應考慮多方面的因素，如接種部位細胞呈遞抗原的能力、細胞的轉染效率、抗原基因的體內表達水平和宿主易感性等。基因重組疫苗的免疫途徑主要有注射、口服、點眼滴鼻、噴霧、電穿孔和基因槍技術等。研究發現，核酸疫苗腿部肌肉注射的效果最優，且抗雞球蟲病指數最高[30]，說明肌肉注射是一種簡單有效的免疫途徑。若以志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特氏菌作為球蟲基因重組疫苗的載體，可采用口服免疫、鼻內滴注或鼻腔噴霧等方法提高粘膜免疫應答，但存在一定局限性。
3.2 免疫劑量
免疫應答強度和免疫保護力與免疫劑量有關。周賽等[31]將柔嫩艾美耳球蟲Mic4-N端蛋白在重組酵母中表達，與AbISCO?-100佐劑結合后進行動物試驗，發現10 μg蛋白+50 μg佐劑組CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分率顯著升高，增重顯著升高，腸道病變計分、糞便OPG值顯著降低，證明免疫劑量是影響抗球蟲效果的因素之一。趙勝杰[32]制備了針對多種艾美耳球蟲的混合DNA疫苗，其中柔嫩艾美耳球蟲的最佳免疫劑量為10 μg，而另外3種球蟲的最佳免疫劑量均為25 μg，說明對于不同種的艾美耳球蟲，疫苗的最佳免疫劑量也不相同。
3.3 免疫次數
由于基因重組疫苗在體內表達量低、持續時間長的特點，免疫次數對免疫效果有很大影響。李祥瑞等[33]將含有生長激素基因的質粒導入小鼠表皮細胞后，88%的被免小鼠產生了抗體，二次加強免疫后抗體水平明顯提高。顧有方等[34]研究了GC02雞球蟲病疫苗的免疫保護效果。結果顯示，二次免疫的效果最優，可有效控制雞球蟲病的發生，且能明顯促進雛雞的生長。說明在初次免疫后，再次或多次加強免疫，可有效提高體液免疫或細胞免疫應答水平。
4 展 望
近年來，隨著公眾對食品安全的重視以及病原耐藥性的問題，疫苗已代替藥物成為球蟲病防控的流行趨勢。相較于活卵囊疫苗，基因重組疫苗制作成本更低，可誘導機體產生高水平保護性免疫，已成為當前研究熱點。不同發育階段的球蟲，其抗原組成與免疫原性也不同，因此，將不同球蟲保護性抗原基因連接到表達載體中，構建多價多表位基因重組疫苗將是未來基因重組疫苗研究的趨勢。此外，利用細胞因子構建免疫調節型基因重組疫苗可以提高抗原呈遞效率，增強免疫效果，具有較好的應用前景。
動物醫學論文范文 第7篇
題目：基層獸醫豬病料常用采集操作技術
摘要：本文就基層獸醫豬病料采集的原則進行了介紹，提出了不同病料常用的采集操作技術，希望能夠為基層獸醫提供參考以及借鑒，不斷提高檢測結果的準確性。
關鍵詞：基層獸醫;豬;病料;采集;原則;技術
基層獸醫在日常對豬病診斷過程中，常常會遇到很難通過感官確診或者定性的疾病，此時需要采取實驗室診斷方法確診。在實驗室診斷前，首先需要采集病料，只有掌握豬病料采集技術要點，嚴格并且嚴謹的實施病料采集，才可保證疫病監測以及治療工作的順利開展。
1 病料采集的原則
1.1無菌采集。在病料采集過程中，必須保證全程無菌操作。尤其是需要進行血清學檢查以及微生物檢查的樣本。所采用容器以及器械等必須經過嚴格的消毒處理，嚴格按照相關無菌操作規程進行操作。
1.2典型性。應保證所采集用于檢疫的飼料具備代表性以及針對性。結合病害流行的特點明確需要采集病料的種類，在此基礎上選擇病料組織、分泌物以及排泄物等。
在此過程中需要注意，在選取動物過程中需要遵循典型性原則，保證所選擇動物沒有經過藥物治療，其臨床癥狀具備代表性，在檢查細菌性傳染性疾病時尤為重要。
另外，選取病料時也需遵循典型性原則，盡可能選擇病原體含量較高的病料。在準備采集病料前，首先需要對感染病害進行初步診斷，重點對常常受到病原體侵害的部位采集。
1.3適時性。應當準確把握病料的采集時間，尤其在夏季需要將采集時間控制在4h以內。如果采集時間過長，常常會導致病料組織發生腐爛現象，很難檢測出原有病原組織。如果情況所需，應對早期發病的活體組織進行急宰并采集病料組織[1]。
1.4安全采集。在樣本采集過程中，必須保證操作的安全性，在防止人員受到感染的同時避免因病原菌發生擴散而導致感染面積的增大。如果病豬為疑似炭疽病，不得立即為其剖檢，而是需要切開其頸靜脈處的皮膚，將少量血液抽出后制作壓片以開展血片檢查。
2 病料采集操作技術
2.1 采集前準備。
2.1.1 人員。在病料采集前，必須對采集人員開展相關業務培訓工作，保證其具備足夠的生物安全意識。例如，如果病豬患有疑似非洲豬瘟疫情，采集人員在采集之前必須明確掌握非洲豬瘟傳播、感染以及預防相關知識，同時能夠對生豬進行熟練保定病采集病料。
2.1.2 物品。結合需要采集的病料制定一個科學合理的采集計劃，同時做好所需物品的準備工作。通常情況下，需要為采集操作準備各種類型的手術器械、病料包裝袋、容器以及消毒劑等。
對于在病料采集過程中需要使用的各種手術器械，必須提前在121℃下高壓滅菌30min。對于注射器、采血針以及采血管等，需要使用一次性無菌制品;如果不具備一次性物品，必須再使用前落實無菌處理。對病料采集過程中需對70%的酒精、福爾馬林固定液、保存液、其他消毒液等各種所需溶液進行配制。另外，還需提前準備防護服、防護口罩、無菌手套、病料采集單、記號筆、護目鏡以及膠靴等。
2.1.3 環境。在采集病料之前，首先需要選擇最為適宜的病料采集位置，同時對病料采集環境進行嚴格的消毒。嚴格處理各種廢棄物，防止病毒傳播擴散，避免發生污染。
在病料采集過程中所使用的手術刀片以及注射器針頭等在使用完畢后需要立即置于封閉的銳器盒內，同時進行嚴格的無害化處理;對于一次性防護用品以及注射器等，則需置入密封袋無害化處理。
在病料采集工作結束后，需要及時采用消毒劑對動物尸體進行噴灑消毒，接著裝入密封袋中無害處處理。采集人員需要更衣消毒，對環境進行有效的清潔以及徹底的消毒。
2.2 病料采集方法。采集人員需要嚴格按照相關操作規程開展病料采集工作。
2.2.1 血液采集。豬只不僅脂肪層較厚，同時具備較厚的肌肉層，通常情況下很難直接觸及其血管，因而對其采集血液難度較大。在臨床上，血液采集方法較多，但是要想在獲取大量血液的同時使采血速度得到保障，通常采用頸靜脈采血方式以及前腔靜脈采血方式。可以結合豬只大小等各種客觀因素靈活選擇適宜的采血方法[2]。
(1)頸靜脈采血。對豬只進行站立式保定，保證被保定豬只頭部處于垂直上舉狀態，同時身體與頭部垂直不存在扭曲現象。操作人員需要從豬只頸靜脈溝處將針刺入，對著微偏中心線背部方向抽取血液。
(2)前腔靜脈。與頸靜脈采血方式采取同樣的保定方法。在保定好后，豬只頸根部以及胸骨之間會出現一個凹陷窩。在采血過程中，將針頭對著凹陷窩的位置刺入，刺入方向為一側肩胛骨頂端方向。另外，病豬機體左側內，心臟以及膈肌內存在著較多的迷走神經，但是其右側較少。在扎針過程中，一旦碰到迷走神經，常常會導致豬只出現抽搐以及呼吸困難等各種癥狀。因而，在采血過程中在凹陷窩位置入針以后將插針方向控制在向右肩胛骨方向。
(3)血液處理方法。在病原學檢測過程中，需要采用具備抗凝功能的血液。在采集過程中，所采用真空采血管內應當已經加入了枸櫞酸鈉、EDTA或者肝素等各種抗凝劑，或者抽取果抗凝劑浸潤過的注射器。嚴禁對所采集血液進行冷凍保存，將其保存溫度控制在2-10℃，嚴格控制保存時間，不得超過24h。如果保存時間過長，紅細胞極容易發生變形或者破裂，使顯微鏡的觀察受到影響。
如果需要進行血清學檢測，在檢測之前首先需要制備血清。通常情況下通過離心分離來制備血清，在離心之前，需要將血液保存于溫度為4℃的冰箱內2h，以促進血清的析出[3]。離心過程中，將離心機的轉速控制在2000r/min，離心時間控制在10min。另外，也可以將血液在采血管內自然放置12-24h從而將血清析出。可以采用冷凍方式對血清進行保存，但是冷凍保存方式保存時間不宜超過7天。在此過程中需要注意，反復凍融會導致血清內物質的活性遭到破壞，使評價工作受到影響。
2.2.2 組織采集方法。在組織病料采集過程中，需要遵循無菌操作，保證一畜一套器械。在采集心臟、淋巴結、腎臟以及脾臟等病變臟器組織時，必須保證操作迅速，尤其是在氣溫較高的夏季，需要將采集時間控制在4h內，如果采集時間過長，組織器官常常會發生自溶、腐敗以及變性等各種情況，使檢驗效果受到影響。在活體病料采集過程中，如果為多只動物發病，首先對存在明顯癥狀的豬只采集。需要將所采集病料置于50%的甘油緩沖液內保存并送檢。如果需要開展病理組織學檢查，需要將所采集組織置于95%的酒精中或者福爾馬林溶液當中。固定組織以及固定液的體積比為1：10，通常在固定后24h需要對固定液進行1次更換。對待送檢病料進行編號，同時做好其記錄工作。妥善包裝送檢病料，例如組織病料以及血液需要冷藏保存，而病理學材料不得冰凍。
2.2.3 尿液。在豬只排尿過程中，采取一次性塑料杯接取其尿液。
2.2.4 糞便。采用無菌棉拭子從豬只直腸內或者肛門內壁部位沾取新鮮的糞便，接著將棉拭子置于密封袋內，在此過程中折斷并舍棄手拿捏棉拭子柄的位置，以防所采集糞便受到污染[4]。
2.2.5 鼻分泌物。采用無菌棉拭子沾取豬只鼻腔內或者鼻鏡內的黏液。接著采用與糞便采集同樣的方式將其置于密封袋內。
2.2.6 皮膚。采用鋒利的外科刀具從病變皮膚部位刮取皮屑、結痂以及毛發等并置于容器內。
2.2.7 乳汁。采用消毒液對乳房、乳房附近毛發進行消毒。棄取最初幾股乳汁，接著采集10-20ml乳汁并置于滅菌容器當中。
參考文獻
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動物醫學論文范文 第8篇
題目：奶牛乳房炎診斷方法研究進展
乳制品已成為人民日常生活不可或缺的主要食品，其產業發展與奶牛養殖業密不可分。奶牛乳房炎(bovine mastitis，BM)是嚴重危害奶牛養殖業的重要疾病之一[1]，其診斷技術水平直接反映國家畜牧業發展水平和科技實力。本文主要論述了不同診斷方法的優缺點，并思考了如何將診斷技術更好地應用于實際生產中，以期為防治該病和開發診斷新技術提供參考。
1 奶牛乳房炎概況
1.1 流行現狀及危害
奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化學、致病微生物以及其他因素所引起的一種炎性變化，主要表現為乳汁理化性質改變、體細胞數變化以及乳腺組織病理學變化。據報道，全世界每年因乳房炎經濟損失達350億美元，僅美國奶業損失每年可達20多億美元，在我國奶牛乳房炎發病率約為46%～70%[2]。其危害主要體現在以下幾方面：(1)可致泌乳量降低10%～15%及乳質量變差，治療不當可致終身不產乳[3]。(2)影響繁殖性能且導致奶牛淘汰率達9%～10%[4]。(3)病牛乳汁含有非乳源性雜質或治療的抗生素等藥物殘留，影響食品安全。
1.2 分類及發病機制
根據乳汁肉眼可見變化，可分為臨床型乳房炎(clinical mastitis，CM)、隱性乳房炎(subclinical mastitis，SM)和慢性乳房炎。根據發病特點和病理變化又分為漿液性乳房炎、卡他性乳房炎、纖維蛋性乳房炎、出血性乳房炎、化膿性乳房炎、壞疸性乳房炎。
乳房炎發生主要包括3個時期[5]：(1)因各種不良因素，致使病原菌從乳頭口入侵乳頭管;(2)病原菌侵入乳腺組織后，在乳房內繁殖進而導致重復感染;(3)乳腺組織發生炎癥反應。
2 奶牛乳房炎診斷技術
2.1 病原菌分離
病原菌分離常被認為是傳統診斷的“金標準”，分離培養出的病原菌對于抗生素選擇使用有許多優勢。但該方法對隱性乳房炎鑒定準確性低、耗時長、變異性較大，易出現假陰性。
2.2 體細胞計數法
體細胞計數法有直接和間接計數法兩種。直接計數法主要用儀器進行測定，如利拉伐細胞計數器、Fossomatic 細胞計數器等簡單準確，可自動地分析大量樣本。但花費高，使用不普遍。
間接計數法主要是破壞乳汁中體細胞，使其釋放核酸物質，進一步反應會產生沉淀或凝膠。研究表明，乳汁體細胞數低于2×105個/mL為陰性，在2×105個/mL～5×105個/mL之間為可疑，大于或等于5×105個/mL則判定為隱性乳房炎[6]。基于此原理，常用的有美國加州乳房炎診斷試劑(CMT)，但其準確度(87.4%～90.8%)較低。在我國也有蘭州(LMT)、北京(BMT)和杭州(HMT)等診斷試劑。該方法較為費力且不適合初乳期和泌乳后期，在大型奶牛場中可作為輔助診斷。
2.3 分子生物學診斷
分子生物學技術包括聚合酶鏈式反應(PCR)、環介導的等溫擴增(LAMP)和多重實時PCR等，可檢測引起亞臨床乳房炎的病原體或其遺傳物質。PCR一般以16S～23S rRNA間隔保守區為擴增序列。希尼尼根等[7]建立了可同時檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、牛支原體的多重PCR方法，該方法敏感性分別為10 pg/μL、1 pg/μL和10 pg/μL。
LAMP具有鈣黃綠素介導的量熱無線檢測系統，可在65 min內有效檢測病原體，更適用于金黃色葡萄球菌快速檢測[8]。Kawai等[9]選擇引起乳房炎的12個屬的病原微生物，利用32個引物以及能同時檢測所有病原的DNA芯片，通過LAMP優化DNA擴增條件，與細菌培養結果相比，當培養法設置為100%時，DNA芯片的總陽性率為85.0%，總陰性率為86.9%，此方法可快速準確檢測到乳房炎的病原。
多重實時熒光定量PCR是傳統PCR的改進，利用熒光信號積累對擴增的DNA進行實時監測。張莉莉等[10]針對大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的保守序列設計合成了3套特異性引物,通過優化PCR反應體系和反應條件,建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法,最低檢測濃度分別為102、103、104拷貝數/μL,敏感性較高，DNA各個拷貝數濃度變異系數均低于2.02%，重復性良好，具有良好的推廣應用價值。與傳統培養方法相比，PCR診斷技術特異性強、敏感性高、操作方便、耗時短且誤差小。
2.4 生物物理技術診斷
電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和紅外熱成像(IRT)均能顯著促進乳腺炎相關病原菌的鑒定，允許從物種水平對細菌進行準確鑒定。Magro等[11]研究，基于質譜原理的MALDI-TOFMS可在極短時間內測定細菌種類或其蛋白質。該技術特異性強和靈敏度高，能替代或補充通過表型方法進行鑒定，但僅適用于現有細菌蛋白質譜的特定光譜數據庫，如廣泛使用不太經濟。
傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術基于對全生物體DNA鑒定，通過被測物種的光譜與參考數據庫中已知物種的光譜進行比對，可在亞種或品系水平上區分乳房炎病原體生物，分別使用FTIR和MALDI-TOF MS方法鑒定牛乳腺炎相關的革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性球菌，其正確率分別為100%和90.5%，前者略優于質譜法[12-13]。
紅外熱成像(IRT)基于皮膚或乳房表面的熱或溫差，以圖像形式反映。其高靈敏度熱感相機可檢測乳房表面溫度的微小變化或炎癥，通過移動信息技術應用，可以成為一個便攜式診斷工具[14]，其敏感性和特異性分別為95.6%和93.6%[15]。其敏感性和特異性雖然很高，但在實際操作中難度大，有待進一步研究。
2.5 基于傳感器的乳房炎診斷
在診斷領域，監測奶牛乳房炎發病時或發病前行為變化極其重要。奶牛在采食量和整體活動方面變化顯著，這些疾病跡象在臨床癥狀出現前幾天就很明顯，因此可作為監測指標。Chinnappan等[16]基于磁性納米顆粒，通過使用纖溶酶的蛋白水解活性作為生物標記，開發了一種特異性檢測金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌的比色生物傳感器，其靈敏度在體外測定為1 ng/mL纖溶酶。該方法能區分健康乳和病乳，且在乳房炎診斷過程中反應迅速、簡單、靈敏、潛力大，可用作初始診斷。
2.6 蛋白質組學分析
蛋白質組學方法在診斷、預測和預防奶牛乳房炎以及標準化質量方面非常有用。這種方法有助于鑒定乳房內感染(IMI)生物標志物[17-19]。研究表明，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)就是一種重要的BM炎癥標志物，基于此可對全乳復雜基質進行分析[20]。一些組合策略液已被用于奶牛乳房炎期間牛奶的蛋白質組分析，如雙向凝膠電泳后的MALDI-TOFMS(2D-GE)，液相色譜和串聯質譜的聯合應用。Abdelmegid等[17]采用二維差異凝膠電泳(2D-DIGE )結合液相色譜和串聯質譜技術，從具有肥大癥狀的病乳中檢測到28種高豐度蛋白，其中9種具有宿主防御功能，這些蛋白包括參與先天免疫和抗菌功能的急性期蛋白以及與病原體免疫反應相關的蛋白，可成為奶牛隱性乳房炎潛在的候選生物標志物。
2.7 特異性免疫分析
根據抗原抗體反應特性，免疫檢測成為診斷亞臨床乳腺炎的有效方法，如乳膠凝集法、免疫層析法[21]。Jaeger等[22]利用牛乳淀粉樣蛋白A作為檢測亞臨床乳房炎的生物標志物，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行了檢測，其結果對主要病原體檢測靈敏度為81.4%、特異性為93.4%，對全病原體檢測靈敏度為88.0%、特異性為65.2%。與常規酶聯免疫吸附試驗相比，基于磁珠的酶聯免疫吸附試驗具有快速、操作簡單、檢測試劑少的優勢。但可能存在由于交叉反應導致非特異性高缺點。此外，成本較高，對基礎設施和人員技術熟練的要求高。
2.8 基因測序分析
基因分型、指紋識別已經成為一種重要的奶牛乳房炎診斷工具，不僅用于微生物的種、亞種、菌株水平鑒定，還用于流行病學研究。核糖分型、脈沖場凝膠電泳(PFGE)，擴增片段長度多態性(AFLP)、隨機擴增多態DNA(RAPD)和多位點序列分型(MLST)經常被用于基因分型[23,24]。Pumipuntu等[25]使用PFGE和MLST進行金黃色葡萄球菌引起牛乳房炎的各菌株基因分型鑒定，發現凝固酶陽性分離株具有11 種不同的PFGE模式和一種不可分型模式，其中個別模式與多位點ST無關，在金黃色葡萄球菌中發現了3個新的ST隔離。陳婷婷等[26]利用多位點序列分型(MLST)對甘肅部分地區奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌進行了檢測，發現26株金黃色葡萄球菌中存在9種ST序列型，其中ST59為優勢序列型。本方法具有方便、準確的特點，但因其成本昂貴、耗時長，現階段難以投入臨床使用。
3 奶牛乳房炎診斷在防治中應用的思考
3.1 早期快速準確診斷是做好防治工作的重要前提
奶牛乳房炎因素多，涉及病原廣，以分子生物學及免疫學技術為基礎，開發現場快速及實驗室高通量快速準確診斷技術將是未來發展趨勢，如多病原基因芯片或蛋白芯片技術，基因組、蛋白質組及代謝組學技術。此外，智能化、信息化技術結合也是診斷領域研發熱點，如生物傳感器技術有望成為檢測奶牛乳腺炎的重要工具。各方法優缺點不同，單一應用無法達到理想目標。因此，多種方法聯合應用可更準確的防治，如以PCR檢測為主，體細胞計數法檢測相結合的應用。
3.2 特征性生理指標及代謝產物等檢測技術開發是做好防治工作的重要支撐
隱性乳房炎系診斷領域重要課題。及時監測奶牛采食量及整體活動方面的變化，如用IRT技術監測奶牛乳房表面溫度，再通過檢測乳汁中一些酶活性物質的活性或代謝產生的微量元素來客觀評估乳房炎的病程情況，為實施綜合治療方案提供支撐。
3.3 簡便、快捷的適用技術廣泛推廣是臨床診斷的迫切要求
不同規模的養殖場應采取相適應的檢測技術，在大型規模化養殖場中，奶牛數量多，若用常規檢測，則費時費力，貽誤病情。應利用數字化、信息化、人工智能等相關技術使用傳感器數據來改善乳房炎管理的新方法。在小型養殖場中，飼養及相關獸醫技術人員層次不齊，開發類似乳汁電導率檢測、乳汁pH測定、乳清中蛋白含量測定以及現場熒光定量PCR、試紙條、LAMP等簡便、適用技術，是進行快速推廣和實現及時快速處置的有效手段。
動物醫學論文范文 第9篇
題目：綿羊短尾表型研究進展
世界上脊椎動物的尾巴大部分是天生的，尾巴被賦予了獨特的功能，如維持身體平衡、同一物種間的通訊工具和攻擊、儲存營養、運動、體溫調節等[1]，研究人員發現一類動物的尾部長度明顯短于此范圍，這種現象可以穩定地遺傳給后代，“短尾征”也以此現象命名[2]。在進化過程中，犬、貓、鼠、猴等動物也出現了尾巴缺失或縮短的情況。綿羊也不例外，國內外研究者因此提出了綿羊“短尾征”的概念。目前，動物短尾的成因已成為動物遺傳學的重要研究內容之一。然而，國際權威網站上關于“短尾征”的研究論文主要集中在犬、貓、小鼠的短尾形成方面，綿羊短尾機制的研究較少。
中國地方綿羊品種按尾型分為5種，即短肥尾羊、長肥尾羊、短瘦尾羊、長瘦尾羊、肥臀羊。根據歷史、考古和遺傳學證據，蒙古羊是中國短尾羊品種的共同祖先。隨著對健康、營養和肥胖認識的不斷提高,人們對肉類食品質量的要求逐漸提高，脂肪含量已成為衡量肉類食品質量的主要因素，脂肪的過度積累將嚴重影響動物的健康和肉類食品的品質和口感，因此高蛋白羊肉在畜牧產品市場越來越受消費者的歡迎。因此，綜合考慮消費者健康及牧民的養殖效益，養殖短尾羊已經成為養殖業的新選擇。在眾多短尾綿羊品種中，呼倫貝爾短尾綿羊因其高蛋白質含量、獨特的肉質、高瘦肉率和遺傳穩定而脫穎而出。呼倫貝爾羊有2個品種，即“短尾羊”和“大尾羊”。由于不同綿羊尾部性狀存在諸多差異，造成此差異的遺傳學機制還不明確，因此研究控制綿羊尾部表型的形成機制至關重要。論文在綿羊短尾性狀遺傳學機制研究上做一綜述，以期對了解和研究控制綿羊尾部大小的分子機制提供理論基礎。
1 綿羊尾部及短尾表型形成機制研究
研究人員發現，綿羊短尾表型的形成主要是由于尾部脂肪沉積和尾椎骨畸形[3]。目前，蒙古羊是中國分布最廣、數量最多的綿羊品種。隨著貿易、民族間戰爭和草原部落向南移動，除了內蒙古自治區外，蒙古羊被傳入中國新疆、甘肅、青海、河南、山東、江蘇、浙江等省份，是我國寶貴的畜牧遺傳資源之一。目前，由于消費者對肉類的低脂肪、高蛋白、高營養等健康食品的要求，越來越多的牧民正在繁殖和擴大綿羊中的短尾型綿羊的養殖。這使得綿羊短尾表型形成機制成為了眾多科研人員研究的熱點問題。對于尾部脂肪沉積與尾椎骨畸形兩方面的研究內容，不同的研究人員得出了不同的研究結論，但是，現階段大部分相關研究更多的聚焦于某一種引起短尾性狀的生物分子學機制，這可能與不同類短尾表型綿羊所在地域和人工繁育以及研究時所選參考基因組版本等諸多因素密切相關。現有研究顯示，雖然不同地區短尾綿羊在表型上有一定的差異，但絕大部分表型是脂尾短厚而寬，部分覆蓋或完全露出肛門、外陰。
1.1 影響短尾綿羊尾部脂肪沉積的因素探討
儲存在羊尾巴上的脂肪與儲存在駱駝駝峰上的脂肪起著相同的作用，幫助它們在環境惡劣、食物資源匱乏的不利環境中生存。在食物充足的情況下，肥尾羊會在尾部儲存大量多余脂肪，形成一條又長又大的肥尾巴。由于綿羊脂肪的積累需要攝取更多的能量，所以會降低綿羊的經濟價值。發展和繁殖短尾型綿羊的目的是為了提高綿羊飼養過程中的肉類比例，滿足消費者對健康食品的需求。早期的研究表明，影響綿羊尾巴沉積的基因不會影響綿羊的整體脂肪水平，而只影響身體某些部位的脂肪沉積[4]。一些研究人員直接以綿羊的尾巴為研究對象，篩選和鑒定與尾巴脂肪積累相關的基因。
1.1.1 基因 文獻[4]選擇湖羊(短肥尾)和藏羊(短瘦尾)作為研究對象，該研究指出，綿羊尾巴中的脂肪沉積和綿羊尾巴長度的類型可能與BMP2蛋白有關。另外，Bmp2基因直接參與了綿羊胚胎時期的形態和體節的發育[5]。Bmp2基因與非洲爪蟾尾巴的再生和發育有關，這一點在非洲爪蟾的研究中也得到了證實，并且Bmp2基因作為轉錄抑制劑直接受Vrtn基因調控。Vrtn基因也是控制綿羊和豬脊椎動物數量的主要候選基因。綜合來看，Bmp2基因可能在動物骨骼發育過程中起作用。與大尾羊相比，短尾羊的尾骨數量與脂肪量明顯較少，但Bmp2促進脂肪的形成和成骨細胞的分化，調節綿羊尾骨數量或直接參與綿羊尾巴脂肪的積累，影響脂肪積累量[6]。該項研究推測得出尾椎體數量的增加與脂肪沉積量的增加有密切的關系。
1.1.2 蛋白 在蛋白質組學的研究方面，有研究成果表明FABP4蛋白在尾部沉積中起著重要作用[7]，PPAR信號通路中的差異表達蛋白可能調節脂肪細胞的代謝和分化。參與PPAR信號通路的差異表達蛋白可能發揮了對綿羊尾臀部脂肪細胞的分化與脂質代謝的調節作用，特別是肥尾型綿羊的FABP4蛋白的高表達。Han J等的研究篩選得到了大尾羊中有幾種與脂肪沉積和脂肪形成相關的功能候選基因包括acsl1、acaca、acly、fasn、atgl和hsl，這些基因已被驗證為決定脂肪組織脂質代謝的重要因素[7]。同時，該項研究檢測到acsl1、acaca、acly和fasn這4種基因分別在大尾綿羊尾部中上調，這些上調的蛋白質可能在調節脂肪酸的運輸、合成和脂肪組織的形成方面起重要作用[8，9]。脂肪細胞的生長和分化導致脂肪細胞的質量增加和脂肪的積累，都是產生脂肪的主要原因[10]。PPAR信號通路對調節脂肪細胞分化和脂肪細胞增殖起著重要作用[11]，PPAR信號通路中的基因(包括Fabp4、Fabp5、Acaa1、Acsl1、Lpl、Acsl6、Plin4、Plin1、Scd和Adipoq)在大尾羊尾部基因表達明顯上調。PPAR信號通路中這些上調的基因可能有助于綿羊尾部或臀部的脂肪沉積[12]。
在Ren X[13]等使用了SNP基因分型技術的研究中，發現4個候選基因(Rip140、Ctbp1、Steap4和Creb1)可能與綿羊尾部脂肪沉積相關。Hongying Fan[14]等人以呼倫貝爾短尾羊與巴爾虎羊(大尾羊)為研究對象，并進行轉錄組測序發現Hadnb、Echs1、Acsl5、Hadh和Ppt1這5個基因表達上調，Cpt1b和Gcdh2個基因表達下調，通過對短尾母羊與大尾母羊的數據分析發現大尾羊尾巴中有7個基因(Fads1、Fads2、Acsl1、Elovl5、Plin1、Ehhadh和Acald)上調，這解釋了呼倫貝爾短尾羊和巴爾虎羊尾脂肪相關基因的差異表達。
Zhang等[15]對細尾羊和肥尾羊品種的研究中，染色體5、7和X被確定為影響脂肪沉積的3個基因組區域。Moioli等[16]對2個肥尾品種和13個細尾品種數量的標記基因全譜檢測發現，基因Bmp2和Vrtn可能與羊尾型有關。Yuan等[17]在肥尾和細尾羊中檢測到標記基因Bmp2、Hoxa11、Wdr92、Ppp1cc、Sp3、Sp9和Prokr1對肥尾羊和細尾羊的尾部脂肪發育有積極影響，并可通過相關基因的表達促進脂肪分解。對蒙古綿羊尾部脂肪沉積的研究表明，發育基因Hoxc13、Hoxc12、Hoxc11和脂肪尾部表達基因Sp9、Hotair3、Hotair2以及脂肪相關基因Adipoq、Cd36、Fabp4、Fabp5都是形成脂肪沉積的重要基因[18]。
1.1.3 微小核糖核酸miRNA 微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一種非編碼的單鏈RNA分子，由內源性基因編碼，長度約為22個核苷酸。它是由Dicer和Drosha核糖核酸酶Ⅲ蛋白質處理的莖環結構。miRNA在脂肪細胞分化和維持生物穩態中起著決定性作用。Mohammad[19]等以Lori-Bakhtiari羊(寬肥尾)和Zel羊(瘦脂尾)為研究對象，最終篩選出7個不同表達的基因，發現了3個重要的生物過程模塊與胰島素分泌、脂質代謝有關。近年來，關于miRNA在生物體內家畜脂肪組織中的作用的研究越來越多，但關于綿羊miRNA的脂質控制代謝的報道很少。徐紅偉[20]等發現，從形態學和組織學的角度，以小尾寒羊和蘭州大尾寒羊為實驗對象，對尾脂進行組學分析，篩選出不同表達的蛋白質、基因和非編碼RNA(ncRNA)等調控因子，這對了解不同肥尾類型綿羊體脂分布的機理具有重要作用;在小尾寒羊和蘭州大尾巴羊的尾部脂肪組織中，共發現了11種miRNA表達的差異性，其中6種miRNA在不同的脂肪組織中表現的差異特別明顯。顯然，僅通過基因表達譜分析很難準確地找到脂肪沉積的特定調控途徑。有必要在現有基礎上進行深入研究，以揭示羊尾脂肪沉積的確切遺傳機制。
1.1.4 性別因素 性別差異引起二者在新陳代謝上表現出極為顯著的差異，過往研究分析了大量性別差異下的生理學異同，比如，差異化性別間的激素水平與基因表達的不同之處，研究結果顯示，相對于男性腹部，女性臀部與大腿部分的脂肪沉積更明顯。這說明，某些特定部分的脂肪沉積受到獨特基因的控制。所以，在特定部位與不同性別間脂肪沉積的遺傳機制是存在差異的。Hongying Fan[21]對比研究了呼倫貝爾短尾羊和大尾羊2類呼倫貝爾羊的尾部轉錄組測序結果，其創新之處體現在將性別影響因素考慮進來展開研究，在尾部大小一致的兩種性別間對比，結果顯示，大尾羊和小尾羊分別有獨立的9個和12個生物學過程。首先，在尾部大小不一樣的雄性綿羊群中，在13條KEGG信號通路內富集差異基因。在其中確定了與脂肪酸代謝存在相關性的脂肪酸降解、脂肪酸代謝和延伸率三個生物學過程。在尾部大小不一樣的雌性綿羊群中所獲得的差異基因，合計富集到51條KEGG信號通路，而與脂肪沉積存在相關性的信號通路有兩條，參與了脂肪酸代謝和脂肪細胞中脂質降解的調控過程。然而，在短尾羊樣本內與脂肪代謝相關的信號通路僅有PI3K-Akt信號傳導途徑這一條。在對比大尾羊和短尾公羊的差異基因富集的信號通路時發現了與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)相關的信號通路。此項研究確定了7個基因影響PPARG及大量其他調節因子，進而對雄性呼倫貝爾綿羊尾脂肪中與脂肪酸代謝存在相關性的基因表達變化進行了解釋，其中PPT1、HADH、ECHS1、HADHB和ACSL5這5個基因被上調，而CPT1B和GCDH基因則被下調。通過對比分析大尾與短尾母羊的相關數據可知，前者尾部的FADS1、ACADL、FADS2、PLIN1、ELOVL5、ACSL1和EHHADH基因表達都有上調，這7個基因可能影響綿羊胰島素的分泌，并且也能夠對巴爾虎羊與呼倫貝爾短尾羊尾脂肪中與脂肪酸代謝存在相關性的基因的差異表達進行了解釋。
1.2 影響短尾綿羊尾椎骨發育的因素探討
1.2.1Brachyury基因Brachyury基因(T基因)編碼屬于T-box轉錄因子家族的BRACHYURY蛋白。BRACHYURY蛋白的轉錄活性在中胚層的形成和分化中起著關鍵作用[22]。Brachyury/T基因首先在原腸期表達，隨后的表達逐漸局限于發育中的尾芽和脊索，Brachyury/T基因的缺失或不正確表達將導致狗、貓、小鼠和綿羊的正常胚胎發育異常[23]。Brachyury/T基因在脊椎動物發育過程中可調控轉化生長因子和Wnt信號通路，Brachyury/T基因在突變雜合子個體中顯示骨缺損，在突變純合子個體中顯示嚴重的發育障礙，最終導致發育停止和死亡[24]。在對伊朗Dalagh短尾羊和Mehraban羊的研究中，提到純合Brachyury/T突變僅表明這些羊的尾部脊椎發育受到抑制[25]，這表明Brachyury/T突變可能促進大尾羊尾部脂肪的積累。
在J Han[26]等的研究中，特別強調羊尾巴表型與Brachyury/T基因的c.333G與c.G334T 的2個突變有關。對于Brachyury/T中的這2個突變位點，純合基因型為CT/CT，僅存在于短尾綿羊中，但在大尾綿羊中未發現該基因型。Pfam結構域分析表明，333和334個核苷酸分別對應于111和112個氨基酸殘基，短臂蛋白的T盒結構域可以激活基因轉錄。進一步的雜交試驗表明，短尾羊和大尾羊后代Brachyury/T基因的333與334為雜合GG/CT突變，均為長尾或正常表型。結果表明，GG單倍型為單顯性基因遺傳，CT/CT可能為“短尾”表型的隱性基因型。僅通過對Brachyury/T基因表達的分析，很難了解尾椎體畸形的具體調控途徑。有必要在現有研究的基礎上進一步研究，以揭示綿羊尾部脂肪沉積的確切遺傳機制。
1.2.2 其他基因 MGI數據庫內記載了與短尾表型存在相關性的多種基因。對于小鼠身上導致短或異常尾巴的一系列不同基因可被視為是綿陽等其他短尾動物的候選基因。在關于鼠的研究中，從遺傳學維度分析了軸向骨骼發育，研究結果顯示，大量不同類基因與突變參與了尾椎骨的發育，并影響到機體的生殖力、體細胞與減數分裂，進而清晰地揭示了脊椎動物的進化過程[27]。
Pax1基因(成對框基因1)主要參與了骨骼發育和轉錄調控過程。在脊柱動物胚胎階段脊柱發育過程中發揮著關鍵性的作用[28]。Pax1在小鼠中3個等位基因突變導致出現短尾或無尾現象，Pax1基因參與生骨節凝聚過程，且腰骶椎周圍并未發生內側生骨節的凝聚過程，因為不能正常無成此地程，使椎體與椎間盤無法正常生成[29]。
Wnt3a基因是Wnt家族中的一個成員，其對胚胎期神經后軸的增殖與體節發育都不可或缺[30]。去除此基因的小鼠，由于尾芽不能正常發育使得其身形變短，純合突變的小鼠尾部大幅變形，表現出短尾、絲狀尾和無尾等現象，尾椎骨不完整，椎體外形不正常。一些小鼠甚至缺少骶骨前椎體，并在這些部位可觀察到畸形的尾部神經管。
再者，還有HES7基因[31]、Bmper[32]、Dvl2[33]和T基因[34]等。但是，考慮到動物的尾部形態類型多樣，只是研究鼠這一種動物，是不可能下結論解釋其他哺乳動物尾巴的多樣性。所以，需要進一步研究非模型物種，深入全面地研究綿羊等非鼠類哺乳動物尾巴的多樣性機制。
2 展望
綿羊尾部脂肪堆積過多，尾部過大，無法滿足目前人們對優質肉類的需求。綿羊尾巴脂肪積累和綿羊尾骨發育畸形的遺傳調節機制對綿羊新品種的選擇具有重要意義。論文從影響短尾綿羊尾部脂肪沉積的因素、影響短尾綿羊尾椎骨發育的因素深入探討綿羊短尾表型形成機制，綜述了基因、蛋白、miRNA和性別對綿羊尾部脂肪沉積的影響以及Brachyury基因和其他基因對短尾綿羊尾椎骨發育的影響。通過總結國內外綿羊短尾表型形成機制的研究現狀，關于綿羊短尾表型形成機制未來優化研究提出若干展望。后續研究中可精準篩選與綿羊尾部脂肪堆積和尾椎骨畸形過程相關的基因，探索綿羊尾部表型的調節機制，對分析綿羊尾部表型的形成具有重要價值，培育短尾和低脂肉用綿羊具有重要的意義。
動物醫學論文范文 第10篇
題目：鴨疫里默氏菌毒力相關因子研究進展
鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)可感染雛鴨、雛火雞、鵝等多種禽類，引發高致病性、接觸性傳染病。本病最早于1932年發現于美國紐約州的長島，其后在英國、加拿大、前蘇聯、澳大利亞等國亦有發生。我國于1982年首次報道有該病的存在。鴨疫里默氏菌病也稱鴨傳染性漿膜炎(Infectious serocitis，IS)，該病主要感染1周齡～8周齡，尤其是2周齡～3周齡的雛鴨，引起多發性、滲出性炎癥和全身性敗血癥。病變主要以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。鴨疫里默氏菌病發病率可達90%以上，病死率高達75%。目前，該病在世界范圍內廣泛流行，是危害養鴨業最為嚴重的細菌性傳染病之一，給養鴨業造成巨大經濟損失。
鴨疫里默氏菌為革蘭氏陰性菌，其菌體細胞壁表面多糖抗原具有多樣性使得該菌的血清型呈多態化。目前確定的鴨疫里默氏菌有20多種血清型，且不同地區流行的血清型存在較大差異。血清1型、2型、10型菌株是近年來國內的優勢流行菌株。不同血清型之間缺乏交叉免疫保護性，生產中多見多種血清型混合感染且新血清型不斷出現的情況，給該病的防控造成很大困難。
病原菌致病是細菌與宿主復雜相互作用的結果。一方面細菌通過表達、分泌多種毒力因子入侵宿主、逃避宿主免疫系統的捕殺并完成在宿主內的繁殖，另一方面宿主通過其防御系統抵抗這些毒力因子的作用。為有效防治鴨疫里默氏菌病，需要深入研究該菌感染的分子機制和毒力因子。近年來，隨著研究的深入，越來越多的RA毒力相關因子被發現和報道[1]。
1 細菌外膜相關組分
1.1 外膜蛋白
外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構成分，位于病原菌表面，也是最先與宿主細胞相互作用的部位，在維持菌體自身結構及物質轉運、致病等方面發揮著重要作用。OMPs還具有較強的免疫原性且能誘導保護性免疫反應[2]。非菌毛黏附素——外膜蛋白A(OmpA)是一種多結構域蛋白，存在于大多數革蘭氏陰性菌的外膜中。OmpA蛋白是鴨疫里默氏菌中最早被鑒定的、具有免疫原性的主要外膜蛋白[2]。研究發現，RA野生株Th4的OmpA基因缺失株Th4ΔompA對Vero細胞的黏附入侵能力顯著低于野生株，且Th4ΔompA對10日齡櫻桃谷鴨的致死力較野生株下降了10倍以上[3]。表明OmpA是RA的一個重要毒力因子。
1.2 表面多糖
1.2.1 脂多糖生物合成相關因子 細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內毒素，是革蘭氏陰性菌胞壁特有的組分。在感染過程中，LPS可激活炎性細胞釋放多種炎癥因子，導致多種生理和病理損傷。LPS由3種不同的成分組成，即脂質A、O抗原和核心寡糖。研究發現，RA Yb2株AS87-04050基因編碼LPS。通過轉座子插入誘變技術使AS87-04050基因失活，銀染鑒定突變株RA2640的LPS形態與野生株不同，在形態結構上由光滑型變為粗糙型;RA2640較野生株對抗生素、消毒劑和正常鴨血清的敏感性更高，且RA2640的毒力降低了10萬倍以上。表明RA AS87-04050基因與RA LPS的生物合成有關，并影響RA的致病性和毒力[4]。
研究者通過構建RA Tn4351轉座子突變文庫，分別篩選到RA CH3菌株M949-1360、M949-RS01035、M949-RS01915基因的缺失突變株RAΔ604、RA1062、RA1067。突變株RAΔ604不能產生LPS，對Vero細胞的黏附入侵能力較野生株下降，且對鴨的半數致死量(median lethal dose，LD50)比野生株高了200倍[5]。突變株RA1062與抗CH3 LPS單克隆抗體作用無反應，LPS表型較CH3野生株粗糙，且對補體依賴性殺傷的敏感性更高，血液細菌載量降低，毒力減弱[6]。M949-RS01915基因參與RA LPS O抗原的合成，其基因缺失突變株RA1067的LPS與野生株相比存在缺陷;RA1067生長較野生株慢，對補體系統更加敏感，對Vero細胞的黏附和侵襲能力均下降，感染鴨血液中菌量也明顯降低，毒力下降了360多倍[7]。以上結果表明RA CH3菌株的M949-RS01915、M949-1360、M949-RS01035基因也與RA LPS的生物合成和RA的毒力有關。
1.2.2 莢膜多糖生物合成相關因子 莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是位于細菌最外面的一層厚度不定的黏液物質，主要由酸性多糖組成。CPS直接與細菌所處的環境接觸，可保護細菌細胞免受宿主免疫機制的影響，包括抗吞噬和抗溶菌活性、免疫逃避和免疫調節，且CPS還具有免疫原性。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli) Wza是一種保守的外膜脂蛋白，參與1族CPS通過外膜的輸出，而Wzc是一種內膜酪氨酸自激酶。Wza-Wzc復合物可以跨越周質，連接內外膜，提供1族CPS輸出途徑，調節1族CPS的合成和輸出。研究發現,RAwza缺失突變株未能產生CPS，缺失株具有更強的疏水性，更易自聚集，形成更多生物膜，毒性比野生型要低[8]。還發現RAwza和wzc雙基因缺失影響了莢膜的生成、輸出和細菌的生長，導致表面疏水性、自凝集能力、生物膜形成能力增強，降低了RA的致病性[8]。以上結果表明，wzc與wza均參與CPS的合成與輸出，并影響RA的毒力。
2 細菌獲鐵系統相關因子
鐵是大多數細菌的基本元素，鐵離子是病原菌重要的生長因子。細菌的獲鐵系統在其感染宿主及致病過程起著重要作用。細菌獲鐵系統的蛋白同時也是重要的毒力因子。
2.1 TonB蛋白
TonB蛋白是革蘭氏陰性菌細胞外膜的一種蛋白，參與鐵等物質的運輸。革蘭氏陰性菌在生長繁殖過程中需要從外界攝取營養物質。一些小分子營養物質可以自由地通過革蘭氏陰性菌的細胞膜，而一些大分子營養物質的轉運需要特異性的TonB復合物依賴性外膜受體進行轉運。TonB復合物由TonB、ExbB、ExbD構成，ExbB和ExbD蛋白質將TonB錨定在細胞質膜中，而作為能量傳遞蛋白的TonB作為二聚體跨越周質空間，與高豐度的外膜受體相互作用。TonB蛋白已被證明對許多細菌病原體的毒性至關重要。
RA預計包含2個TonB-ExbB-ExbD系統[9]，即ExbB1-ExbD1-TonB1和ExbB2-ExbD2-ExbD29-TonB2。研究發現，RA CH3 株TonB1、TonB2基因缺失株CH3△tonB1、CH3△tonB2對Vero細胞的黏附和侵襲較親本株顯著降低，在雛鴨體內的LD50分別比CH3野生株高224倍和87倍，感染后雛鴨血液細菌載量均較CH3親本株顯著降低[9]，表明TonB1和TonB2蛋白都影響RA的毒力。在L-半胱氨酸存在下，RA CH3可以利用血紅素作為唯一的鐵源，但CH3△tonB1出現血紅素鐵獲取缺陷;進一步通過構建雙突變體系統發現，只有當tonB1和tonB2都被突變時，RA CH1株血紅素轉運才被完全取消[9]，表明TonB1和TonB2蛋白還通過參與血紅素在RA中的轉運，影響細菌獲鐵功能和毒力。
2.2 TonB依賴受體TbdR1
TonB依賴受體TbdR1是TonB系統中的一種外膜受體， TbdR1通過與TonB復合物相互作用，參與血紅素鐵的獲取[10]。研究發現，在低鐵環境下，RA CH3株tbdR1基因缺失株CH3△tbdR1比野生株和回補株生長速度慢，生物被膜形成能力較野生株顯著降低，毒力也遠遠低于野生株[10]，表明 TbdR1 是鴨疫里默氏菌的一種毒力因子。
2.3 鐵載體相互作用蛋白
鐵載體相互作用蛋白(siderophore-interacting protein，sip)參與調控鐵載體基因的轉錄翻譯過程，在鐵離子轉運的過程中起著重要作用。研究發現，RA CH3 株sip基因缺失突變株CH3△sip在限鐵的條件下生長增殖緩慢且生物膜形成減少，對Vero細胞的黏附和入侵能力降低，對小鴨的LD50是親本株的 35 倍[11]。還發現23/24(95.83%)RA強毒株具有sip基因[11]。以上結果表明，sip基因參與了RA的鐵吸收且與RA的毒力相關。
除TonB、TbdR1和SIP外，據報道，RA血清1型菌株CH-1的B739-1343(編碼 TonB 依賴性的轉鐵蛋白)，B739-1208(血晶素受體基因)基因編碼蛋白與鐵的攝取有關[12-13]。研究發現，CH-1株B739-1343基因缺失株CH-1ΔB739-1343在缺鐵環境下較親本株生長受到明顯抑制，且對鴨的致病力明顯降低[12]。CH-1 株的B739-1208基因缺失株CH-1ΔB739-1208也喪失了對鐵的攝取能力，生長能力和毒力較親本株顯著下降，感染后鴨血液、肝臟、腦組織的菌載量都顯著降低[13]。以上結果表明B739-1343、B739-1208基因與RA的毒力相關。
3 細菌分泌系統相關因子
致病菌毒力因子的釋放有賴于專屬的分泌系統，許多革蘭氏陰性細菌通過分泌系統將毒力因子從細菌的胞內分泌到宿主細胞或者環境中。已發現的革蘭氏陰性細菌分泌系統有9個(Ⅰ型到Ⅸ型)。sprT、sprA基因是Ⅸ型分泌系統(T9SS)組成元件，研究發現，RA基因缺失株ΔsprT和ΔsprA對10日齡雛鴨的毒力均較親本株顯著下降，血液和脾臟組織中菌載量較親本株低，且對鴨血清殺菌活性的敏感性較親本株高[14]。通過構建RA Yb2菌株Tn4351轉座子突變文庫，篩選到與滑行運動及Ⅸ型分泌系統相關的gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因缺失株[15-20]。毒力測定結果顯示，缺失株Yb2ΔgldG、Yb2ΔgldK、Yb2ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN毒力較Yb2親本株分別下降了2 953倍、7 009倍、184倍、48倍、54倍、110倍[15-20]。缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN感染鴨組織中的細菌量均較親本株顯著降低[17-19]，缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM在滑行運動和蛋白質分泌方面存在缺陷[16-17]。對RA CH-1 的gldK基因缺失株進行研究也發現，CH-1ΔgldK感染后鴨血液、肝臟、腦組織的菌載量明顯低于野生株，對鴨的LD50約為野生株的1.5×103倍，且對鴨的致死率顯著低于野生株[20]。以上結果表明sprT、sprA、gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因與RAⅨ型分泌系統相關，Ⅸ型分泌系統與RA的毒力有關。
4 細菌調控相關因子
鐵攝取調節(ferric uptake regulator，Fur) 蛋白可調控細菌對鐵的攝取和利用，同時對廣泛細胞過程(氧化還原脅迫反應、毒素與毒力因子)具有調控作用。研究發現，RA Fur缺失突變株感染產生的病理損傷較野生株輕，且毒力降低[21]，提示Fur蛋白與RA的毒力相關。通過生物信息學分析發現RAYM-RS09735和RAYM-RS09740是1對PhoP/PhoR雙組份調控系統。RAYM-RS09735/RAYM-RS09740雙基因缺失突變株的LD50> 1011CFU，且缺失株在心臟、大腦、肝臟、血液和脾臟中的菌載量顯著低于野生型，感染雛鴨后毒力顯著降低[22]，表明該雙組份調控系統與菌株的毒力有關。預測發現信號轉導反應調節因子(ArsR)和信號轉導組氨酸激酶(SthK)位于同一操縱子上。通過構建ArsR/SthK雙基因缺失突變株，發現該缺失突變株對鴨的毒力下降[23]，提示ArsR/SthK雙組份與RA的毒力有關。
5 其他
LuxE基因編碼酰基蛋白合成酶(luxE)，該酶激活脂肪酸，形成脂肪酰AMP介導物，并作為生物發光脂肪酸還原系統的第二步發揮作用。研究發現，luxE基因缺失株Yb2ΔAS87-03730在TSB中的生長速度和對Vero細胞的侵襲能力均較親本株顯著降低，LD50約為親本株的80倍，提示AS87-03730與RA的毒力相關[24]。
煙酰胺酶A(PncA)是催化煙酰胺轉化為煙酸的關鍵酶，是NAD挽救途徑中的一個重要反應，影響病原體在細胞內的復制和傳播。通過轉座子技術獲得pncA(AS87 U 01735基因編碼)基因缺失株Yb2ΔpncA，與野生株Yb2相比，缺失株Yb2ΔpncA感染鴨血液中的細菌含量較低，心臟、肝臟和脾臟沒有明顯的組織學變化，對Vero細胞的黏附入侵能力下降，對鴨的毒力下降了488 000倍[25]。表明AS87-03730與RA的毒力相關。
RIA-1614基因(RanB)是RA菌ABC的外排泵組分。研究發現，RA-GD菌株的RIA-1614基因缺失株RA-GD△RIA-1614的LD50值是親本株的43倍，感染雛鴨后的血液細菌載量比親本株降低了38倍，提示RIA-1614蛋白參與了菌株的毒力[26]。
除去以上概述的各種毒力相關因子，已報道的RA毒力相關因子還有CH3株M949-RS00050基因[27]、Yb2株AS87-RS09170(bioF)基因[28]、CH-1株B739-0373基因[29],CH-1株dps基因[30]等。
6 小結
鴨疫里默氏菌作為重要的水禽細菌病病原之一，一直受到研究者的高度關注。該菌引發的疫情多發生于鴨群，但近幾年鵝群暴發該病的報道逐漸增多。雖然商品化的RA疫苗已經廣泛應用于水禽養殖，但生產中該病仍較多發生。且由于抗菌藥物的不規范使用導致耐藥菌株持續增加，使得RA在水禽養殖中的感染更為普遍和嚴重。
近年來，越來越多的鴨疫里默氏菌毒力相關因子被發現和研究，基于毒力因子的基因缺失疫苗研究也在不斷探索。由于RA的毒力因子多種多樣，不同毒力因子在致病過程中發揮的作用也不同。目前很難確定哪種毒力因子在致病過程中占主要地位，且毒力因子在細菌致病過程中的協同作用也需進一步明晰。鑒于細菌毒力系統的復雜性，未來仍有很多問題需要解決。因此，需要進一步探究已知毒力因子的功能，探索已知毒力因子在致病過程中的協同作用，以及鑒定新的毒力相關因子，為闡明RA的致病機制、防治措施提供依據，同時也為新型藥物和疫苗的研發提供新的思路。
動物醫學論文范文 第11篇
題目：豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP4研究進展
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一種高度接觸性傳染病。PRRS俗稱豬藍耳病，由于PRRSV入侵會降低生豬免疫力，常伴隨混合感染而使疾病很難得到有效防控。1987年該病首次在美國報道，1990年荷蘭成功分離PRRSV并命名Lelystad virus(LV)株，1991年在美洲分離出VR2332株，2種PRRSV基因組序列差異較大并分別命名為歐洲株基因Ⅰ型和美洲株基因Ⅱ型。1996年中國首次成功分離到PRRSV[1]，命名為CH-1a。劉光清[2]等對PRRSV CH-1a株ORF1進行測序分析，結果表明ORF1全長11882 bp，與LV株同源性較低，與VR2332株同源性較高。2006年中國暴發以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)為主要病原的“高熱癥”[3]，HP-PRRSV成為中國具有更高致病力流行株，2015年以后NADC-30 like毒株為流行毒株[4]，給中國養豬業造成更嚴重損失。目前一直沒有針對該病毒的有效藥物，疫苗的效果也有限，不斷重組與變異的PRRSV使得PRRS防控形勢更加嚴峻。
PRRSV是一種不分節段、有囊膜單股正鏈RNA病毒，核衣殼外圍包被脂質雙層膜，對一些脂類溶劑如乙醚、氯仿敏感，這些物質會溶解脂質雙層膜而使病毒失活。PRRSV 基因組包括10個開放閱讀框(open reading fame，ORF)。ORF1a和ORF1b占據整個PRRSV基因組3/4，翻譯形成2個多聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab可被NSP4水解成13個非結構蛋白，即NSP lα、NSP lβ及NSP2～NSP12，PRRSV基因組編碼8個結構蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5、GP5a、M、N。
NSP4具有3C樣絲氨酸蛋白酶(3CLSP)活性，最適溫度為8℃，最適pH為7.5，該酶能夠適應高濃度Na+環境，對二價金屬離子(Zn2+、Cu2+)具有較高敏感性且蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)能抑制NSP4 3CLSP活性。NSP4可通過鉸鏈區(hinge region)信號作用主動進入細胞核，因此細胞核存在大量NSP4而細胞漿少量存在，鉸鏈區145-168位氨基酸可影響NSP4核定位。很多病毒與宿主相互作用過程中通過抑制IFN逃避宿主免疫反應，其中PRRSV NSP4能抑制IFN-I產生，且該抑制作用與3CLSP 活性密切相關。PRRSV 3CLSP晶體結構由3部分組成，2個反向平行β折疊桶(結構域Ⅰ和結構域Ⅱ)和1個C末端α/β結構域(結構域Ⅲ)。NSP4 3CLSP活性區域位于結構域Ⅰ和結構域Ⅱ之間，第39位組氨酸(His)、第64位天冬氨酸(Asp)和第118位絲氨酸(Ser)構成His-Asp-Ser 催化三聯體，是NSP4發揮3CLSP活性重要氨基酸位點，這3個氨基酸突變會使3CLSP喪失蛋白酶活性[5]。NSP4 3CLSP參與誘導細胞凋亡反應，可以作為一種重要靶蛋白揭示PRRSV復制機理。NSP4在PRRSV復制早期出現，PRRSV感染早期可在宿主體內檢測到NSP4抗體[6]。對NSP4功能進一步解析，將有助于探索PRRSV免疫逃逸與持續感染，為防控PRRS提供理論基礎。作者對NSP4遺傳變異、對病毒復制影響、誘導細胞凋亡、調節宿主免疫、調控抗病毒反應、與宿主相互作用、在PRRSV檢測方面進行綜述，為疫苗設計與開發藥物提供理論參考。
1 NSP4遺傳變異分析
NSP4基因高度保守，董建國[7]通過對HP-PRRSV HuN4株與PRRSV CH-1a株NSP4氨基酸序列進行比對，發現高致病性HuN4株和CH-1a株NSP4 氨基酸(aa)相似性高達96.5%，僅在7個aa位點存在差異，CH-1a株的第6、76、80、154、178、185、186位的氨基酸分別為精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、纈氨酸(Val)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)，而HuN4株則分別為蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)。此外，NSP4催化三聯體His39-Asp64-Ser118序列保守性高，未發生突變。其中PRRSV NSP4第185位天冬氨酸(Asp)發生突變，影響NSP4切割核轉錄因子(NF-κB)必要調節蛋白(NEMO)和MAVS的能力，從而調控IFN-Ⅰ表達[8]。其他氨基酸突變是否對空間構象造成影響，該影響是否與病毒毒力、細胞噬性相關，還需進一步試驗驗證。Wang[9]等發現NADC30-like株與國內流行疫苗株在NSP4發生重組，是否影響疫苗效果還需進一步研究。
2 NSP4對病毒復制影響
在非結構蛋白前體多聚蛋白pp1a和pp1ab加工過程中，NSP4作為一種重要的復制和轉錄酶，切割PRRSV增殖過程中的多聚蛋白，并且NSP4負責NSP3～NSP12切割。Tian[10]等通過人工合成10條多肽并以之為底物(含NSP4預測切割位點)，通過“多肽底物-反相高效液相色譜”方法體外測定蛋白酶活性，發現NSP4可順式切割NSP4-NSP5，Tian[6]等證實NSP4可反式切割NSP3-NSP4和NSP11-NSP12，NSP4不能在體外切割NSP8-NSP9[11]。董建國[7]利用大腸埃希氏菌表達系統表達并純化PRRSV HuN4株和CH-1a株NSP4重組蛋白，建立體外測定NSP4酶動力學方法，以及PRRSV NSP4熒光定量PCR方法，結果表明CH-1a NSP4體外切割NSP11-NSP12效率高于HuN4株，但HuN4株NSP4基因轉錄水平高于CH-1a株，導致整體上HuN4 NSP4酶催化效率高于CH-1a株，進而快速切割NSP11-NSP12。NSP11可抑制IFN-β產生和宿主先天性免疫，有利于PRRSV增殖，使得相同時間內 HuN4株病毒粒子生成數量多于CH-1a株。Liu[12]等從含駱駝重鏈抗體可變區噬菌體展示文庫中分離出3個PRRSV NSP4特異性納米抗體(Nb41、Nb42、Nb43)，利用慢病毒載體將納米抗體基因導入Marc-145細胞，測試這些細胞內表達的納米抗體與PRRSV NSP4是否互作。結果表明，Nb42識別NSP4非功能表位，Nb41和Nb43通過識別NSP4功能表位抑制PRRSV復制 ，并在0.001感染復數(MOI)或更低感染復數下完全阻斷PRRSV復制。
3 NSP4誘導細胞凋亡
在PRRSV所有結構和非結構蛋白中，NSP4作為最主要凋亡誘導蛋白，一方面可激活促凋亡蛋白Bim，另一方面能夠降解抗凋亡蛋白Bcl-xL，誘導細胞凋亡，凋亡與其3CLSP密切相關[13]。在凋亡過程中，NSP4發揮生物學功能需要宿主細胞蛋白參與，NSP4可以與細胞色素C1(cyto.c1)蛋白互作。NSP4和cyto.c1能在細胞質中共定位，NSP4剪切cyto.c1蛋白具有劑量依賴性特點，而且NSP4任一酶活性氨基酸位點突變均喪失剪切cyto.c1蛋白能力，cyto.c1蛋白E230aa-G231aa是決定NSP4能否切割cyto.c1蛋白關鍵位點[14]。
4 NSP4調節宿主免疫
NSP4在調節宿主免疫方面發揮極其重要的作用。NF-κB必要調節蛋白NEMO是誘導IFN產生的關鍵蛋白，仙臺病毒(SEV)作用于NEMO缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)時，MEF由于缺失NEMO使干擾素調節因子3(IRF3)磷酸化過程受阻，導致IFN-β產生受到抑制。PRRSV感染豬肺泡巨噬細胞(PAM)可抑制IFN-β表達，該抑制作用通過NSP4切割NEMO途徑實現。NSP4在細胞質多個位點與NEMO特異性的相互作用。Chen J Y等研究表明將PRRSV NSP4 第64位的D突變為A后，發現野生型NSP4(NSP-WT)能夠切割宿主蛋白NEMO，而酶活性缺失體不能切割NEMO，得出該切割作用與NSP4酶活性有關，酶活性缺失體不能抑制IFN-β表達[15]。
線粒體定位抗病毒蛋白(MAVS也稱IPS-1、VISA或CARDIF)，缺失會減弱機體對IFN-β的誘導作用。不同PRRSV對IFN-β抑制作用不同，黃琛[16]在PAM驗證出HP-PRRSV NSP4比傳統株CH-1a NSP4對IFN-β抑制作用更強，HP-PRRSV感染明顯下調VISA蛋白水平，但 CH-1a對VISA表達沒有作用。HP-PRRSV NSP4能夠切割維甲酸誘導基因-I(RIG-I)/黑色素瘤相關基因5(MDA5)信號通路中重要接頭分子MAVS及NEMO，NSP4能夠同時抑制IRF3磷酸化和NF-κB活化。HP-PRRSV NSP4切割MAVS及抑制IFN-β的產生依賴其3CLSP活性，與蛋白酶體和細胞凋亡途徑無關。HP-PRRSV NSP4切割接頭分子MAVS的位點位于MAVS第268位谷氨酸(Gln)，切割之后形成兩個片段，使得MAVS喪失誘導IFN-β能力。
NSP4抑制IκB激酶復合體α(IκB kinase α，IκKα)對IFN-β的誘導表達。PRRSV NSP4作為一個絲氨酸蛋白酶與IκKα相互作用，在IκKα兩端特異切割IκKα，NSP4蛋白酶活性在抑制IκKα激活NF-κB通路和IFN-β啟動子活性中發揮關鍵作用，其NSP4保守氨基酸序列His39-Asp64-Ser118催化三聯體任一位點發生氨基酸突變都會影響對IκKα切割，該結果有助于揭示PRRSV逃逸宿主天然免疫機制[17]。
NSP4切割信號轉導及轉錄激活酶2(STAT2)抑制IFN-β表達。PRRSV NSP4蛋白在拮抗JAK-STAT信號通路中發揮重要作用，PRRSV NSP4蛋白依賴其自身絲氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信號通路中重要信號分子STAT2。在JAK-STAT信號通路傳遞途徑中，STAT2與STAT1結合形成異源二聚體，NSP4切割STAT2致使異源二聚體缺乏，干擾素刺激基因因子3(ISGF3)復合體不能與干擾素刺激元件ISRE結合，拮抗IFN-β生成，同時鑒定出NSP4切割STAT2位點是E719[18]。
NSP4可通過多種途徑切割多個信號分子來實現對IFN-β的調控，相關研究表明NSP4氨基酸突變對NSP4誘導IFN-β產生影響。NSP4在細胞核抑制IFN-β產生，NSP4第155位蘇氨酸(Thr)被賴氨酸(Lys)取代可以增加NSP4在細胞核中的分布，從而抑制IFN-β體外轉錄[19]。HP-PRRSV NSP4第185位天冬氨酸(Asp)發生突變，會使NSP4切割NF-κB必要調節蛋白(NEMO)和MAVS能力受損，從而拮抗IFN-β產生[8]。
丁國飛[20]等通過NSP4蛋白質組學方法篩選到包括轉綠因子Snf2相關CBP激活蛋白(SRCAP)在內的42個可能與NSP4互作細胞蛋白，進一步發現PRRSV感染細胞后，NSP4與SRCAP互作激活Notch信號通路，從而促進PRRSV的增殖與復制，揭示了一種全新PRRSV感染機制。
巨噬細胞清道夫受體A(SRA又稱CD204)，可以幫助吞噬細胞識別致病菌。有報道PRRSV侵入機體后，NSP4可通過直接與SRA啟動子-84到-214區域結合抑制SRA基因轉錄，幫助PRRSV逃逸宿主免疫反應。通過與紫外線(UV)滅活的 PRRSV 比較，未滅活的PRRSV感染抑制 SRA轉錄，紫外線UV滅活的PRRSV不能抑制SRA轉錄，NSP4調控 SRA轉錄與PRRSV復制有關[21]。
豬感染HP-PRRSV會阻滯豬白細胞抗原Ⅰ類(SLA-Ⅰ)抗原呈遞途徑。HP-PRRSV感染抑制β2微球蛋白(β2M)的表達，β2M與SLA-I重鏈和可變肽形成異源三聚體復合物，在SLA-Ⅰ抗原呈遞過程中發揮著關鍵作用[22]。NSP4外源性表達在mRNA和蛋白質水平下調β2M的表達，并降低細胞表面SLA-Ⅰ表達。
5 NSP4調控抗病毒反應
PRRSV感染Marc-145細胞顯著下調外源性鋅指抗病毒蛋白(ZAP)表達，NSP4利用3CLSP切割ZAP，從而拮抗ZAP抗病毒作用，NSP4第180位絲氨酸(Ser)是降解ZAP所必需，180位氨基酸突變下調PRRSV降解ZAP能力，從而拮抗其抗病毒作用[23]。楊玉婷[24]通過Western blot發現NSP4在E411位點切割ZAP的能力與NSP4含量呈正相關，自噬溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑不影響NSP4切割ZAP，NSP4酶活突變體喪失對ZAP切割能力，NSP4切割ZAP依賴3CLSP。mRNA脫帽酶1a(DCP1a)是一種免疫調節因子，參與從真核mRNA中去除5′-甲基鳥苷帽，被鑒定為干擾素刺激基因，NSP4也可切割豬mRNA脫帽酶1a(pDCP1a)。PRRSV感染不影響pDCP1a mRNA轉錄和亞細胞定位，通過切割pDCP1a顯著下調pDCP1a的表達，從而致弱pDCP1a抗病毒活性，切割位點位于pDCP1a第238位谷氨酸(E238)[25]。
6 NSP4與宿主相互作用
豬核糖核酸酶L(sRNase L)是一種干擾素誘導產生的抗病毒蛋白，sRNase L激活后參與一系列機體免疫反應，抑制PRRSV在宿主細胞增殖。張梅潔[26]通過構建熒光素酶活性試驗發現與sRNase L互作的PRRSV蛋白是NSP4、NSP12和N，且在細胞內共定位。尹曼曼[27]篩選PAM cDNA文庫中與NSP4相互作用的宿主蛋白，發現豬免疫球蛋白lambda輕鏈相似肽5(sIGLL5)與NSP4互作，NSP4和sIGLL5在HEK-293細胞共定位。PRRSV感染過程中，NSP4可通過與TRIM蛋白家族成員TRIM28互作，介導部分TRIM28以核轉錄蛋白CRM1依賴方式從細胞核轉移至細胞漿中。出核TRIM28作為E3泛素連接酶，使早期自噬調控分子Vps34發生類泛素蛋白修飾，增強Vps34和自噬關鍵調控蛋白復合物Beclin1互作，進而調控細胞自噬體形成[28]。該研究揭示了PRRSV誘導細胞自噬的新分子機制，從蛋白翻譯后修飾角度闡明了PRRSV與宿主細胞的互作機制。RBM39(RNA binding motif protein 39)通過與NSP4互作調節c-Jun磷酸化，進而促進PRRSV感染[29]。此外NSP4可與F-action和myosin ⅡA互作，完成PRRSV在細胞之間的傳遞與感染[30]。
7 NSP4在PRRSV檢測方面應用
NSP4在病毒復制早期出現，并切割其他非結構蛋白，在PRRSV復制周期中存在較長時間，機體感染早期可檢測到NSP4抗體，可用于檢測PRRSV早期感染。同時，NSP4主要是在病毒復制過程中產生，用NSP4作為診斷抗原檢測NSP4抗體可區分自然感染與滅活疫苗免疫接種。Brown E[31]等克隆表達VR2332株NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8，并且以這些蛋白作為包被蛋白分別建立ELISA方法，結果表明NSP2 ELISA和NSP7 ELISA檢測效果最好，NSP4 ELISA與待檢血清反應弱于前兩者。劉磊[32]等以NSP4重組蛋白作為包被抗原，建立了NSP4抗體ELISA檢測方法，并與愛德士IDEXX ELISA檢測結果對比，總符合率為93.19%，結果說明PRRSV NSP4是具有良好潛力的候選蛋白。Cao[33]等開發NSP4蛋白包被間接ELISA(NSP4涂層iELISA)，并將其效果與N涂層iELISA進行了比較，結果表明NSP4涂層和N涂層iELISAs之間一致性為92.2%。此外，檢測了50份接種HP-PRRSV豬血清樣本，用NSP4包被iELISA檢測出PRRS抗體陽性，但N包被iELISA檢測結果陰性，Western blot分析結果與NSP4包被和NSP2包被iELISA分析結果一致性分別為92%和96.1%。結果表明大部分采集自接種活HP-PRRSV菌株的豬血清樣本，其N包被iELISA檢測結果陰性，NSP4包被iELISA檢測結果陽性，因此使用NSP4包被iELISA可以幫助區分HP-PRRSV疫苗的假陰性和真陰性反應。
8 小結
PRRSVNSP4參與多種免疫抑制反應，NSP4具有3CLSP活性，在PRRSV復制、抑制宿主IFN-β產生、誘導宿主細胞凋亡以及在PRRSV檢測等方面具有重要作用[9,34]。PRRSV NSP4基因保守性較高，不同PRRSV之間氨基酸相似性高，根據這一特性未來可開發出針對PRRSV 的高效新型檢測試劑與檢測方法。
PRRSV作為一種免疫抑制性病毒，進化出多種策略逃逸宿主抗病毒天然免疫反應。PRRSV除了能抑制IFN-β產生，還可靶向干擾素誘導基因(ISGs)拮抗宿主抗病毒反應。研究病毒如何逃逸宿主免疫有助于深入解析宿主免疫反應調控機制。作為PRRSV編碼的一種重要蛋白酶，NSP4在拮抗宿主天然免疫反應中發揮重要作用，NSP4除拮抗IFN-Ⅰ信號通路，還可激活Notch信號通路、調控抗原呈遞途徑、參與誘導細胞凋亡等方面協助病毒逃逸宿主免疫應答。NSP4與多種宿主蛋白互作，NSP4具有切割宿主蛋白的作用，這可能成為PRRSV 逃逸宿主免疫反應的主要機制之一。深入研究PRRSV NSP4調節宿主免疫反應機制有助于深入了解PRRSV致病機理并確定其毒力因子，以此為前提可為弱化PRRSV、開發有效疫苗提供新靶點和理論基礎。
PRRSV NSP4作為主要蛋白酶之一，在病毒增殖中發揮重要作用，3C樣絲氨酸蛋白酶特征成為藥物設計重要靶點[17,19]。納米抗體作為治療PRRSV感染的新型抗病毒藥物，有巨大發展潛力。Shi[35]團隊開展靶向NSP4抗病毒藥物篩選，得到2種抑制效果顯著的抗病毒候選藥物。迄今為止，PRRSV仍在全球流行，對養殖業危害巨大，有效防控PRRSV仍是世界性難題，研究PRRSV分子致病機制可為預防與控制該病提供科學依據。
動物醫學論文范文 第12篇
題目：貓毛滴蟲病研究進展
毛滴蟲是一類屬于副基體門的原蟲，以寄生或共生形式、厭氧生活在宿主胃腸道或生殖道，多有3根～5根前鞭毛、氫酶體、副基體及復雜的細胞骨架等結構[1-2]。貓毛滴蟲感染已報道的蟲種有寄生于貓腸道的胎兒三毛滴蟲(Tritrichomonasfoetus)和人五毛滴蟲(Pentatrichomonashominis)及寄生于貓口腔中的口腔毛滴蟲(Trichomonastenax)、布里克西毛滴蟲(Trichomonasbrixi)和貓四毛滴蟲(Tetratrichomonasfelistomae)等[2-3]。T.foetus是引起貓毛滴蟲病的病原，臨床上以慢性大腸性腹瀉為特征[4]。分子分析顯示牛和貓T.foetus分離株在遺傳上有一定差異，分屬于T.foetus的“牛基因型”和“貓基因型”[4-5]。貓作為伴侶動物，與人接觸密切，這引發了人們關于貓是否可引起毛滴蟲人獸共患傳播風險的擔憂。
1 發現歷史
貓毛滴蟲的研究可追溯到20世紀20年代，Da Cunha A M和Muniz J將其命名為貓毛滴蟲(Trichomonasfelis)。1996年,Romatowski J基于光鏡觀察，把貓糞中的滴蟲鑒定為P.hominis;2001年Levy MG首次用分子方法證實T.foetus才是貓滴蟲性腹瀉的真正病原[6-7]。
2 病原與生活史
毛滴蟲僅有滋養體階段，通過縱二分裂進行繁殖，不同蟲種滋養體形態相似，均呈紡錘形或淚滴狀，具特定數量的前鞭毛和1 根與波動膜邊緣連接的后鞭毛，蟲體運動活潑[1]。其中，T.foetus有3根前鞭毛，P.hominis有5根前鞭毛，T.tenax有4根前鞭毛。目前認為貓T.foetus主要經糞-口途徑傳播，而寄生于口腔的毛滴蟲通過飛沫或接觸傳播[3,6,9]。
3 致病性
3.1 胎兒三毛滴蟲
貓毛滴蟲病作為一種新發的貓胃腸道疾病，其發病機制尚不明確。自然感染情況下，T.foetus主要定植在黏膜表面，并與盲腸和結腸的表面上皮接觸。人工感染試驗可觀察到蟲體定植在貓回腸末端、盲腸和結腸。體外研究表明，T.foetus可經特異性配體-受體互作直接黏附在單層腸上皮細胞上[10]。半胱氨酸蛋白酶似乎可介導蟲體在腸黏膜上皮的黏附和細胞毒作用，未來可作為改善該病臨床癥狀的治療目標[11]。
3.2 口腔毛滴蟲
T.tenax感染多見于口腔衛生較差或具牙周疾病的人群[3]。雖然T.tenax具較高蛋白水解活性，可破壞寄生部位黏膜和組織，但普遍認為其與宿主是一種共生關系[9]。
4 臨床癥狀
貓毛滴蟲病臨床癥狀多變，感染較輕時呈亞臨床癥狀，嚴重感染時出現慢性頑固性腹瀉。人工口服攻蟲后，貓可出現慢性或間歇性腹瀉，糞便呈半成形，半流質或液態，黃綠色，惡臭，有時有糞便帶血、黏液，大便失禁、里急后重，腸胃脹氣等癥狀，可持續2 d～7 d。嚴重感染病例，會出現明顯肛門炎癥和直腸脫垂等[1,6]。上述臨床癥狀多呈間歇性，在使用藥物治療后好轉，停藥后可復發[12]。
5 流行
5.1 貓腸道毛滴蟲
貓T.foetus呈全球流行，貓T.foetus感染率為0～81.8%，見表1[6]。不同的研究者調查時采用的方法不盡相同，早期的調查多采用培養法和直接涂片鏡檢，近期多采用分子方法，一些國家僅有貓T.foetus病例報道，尚無貓群中T.foetus流行的相關數據可供參考[13]。現有研究中，調查樣本來源多樣，如采集自腹瀉貓、參加會展的貓、寄養貓、或獸醫診所就診貓等，有的樣本有臨床癥狀，有的無臨床癥狀等，因此現有流行數據可能存在與此類樣本、調查方法等相關聯的偏差[13]。一些早期病例報道中，曾把T.foetus誤判為P.hominis。近期關于貓P.hominis流行的報道也不多，目前僅見日本寵物店貓P.hominis感染率為0.5%(2/409)，國內某動物醫院門診貓P.hominis感染率為5.3%(3/57)，且存在T.foetus和P.hominis混合感染，混合感染率為3.5%(2/57)[15-16]。
表1 全球貓T.foetus流行情況
5.2 貓口腔毛滴蟲
Kellerov P和Tachezy J[3]報道捷克貓T.tenax感染率為4.1%(5/111)，T.brixi感染率為6.6%(7/111)。Dybicz M等[5]報道波蘭貓T.tenax感染率為2.1%(3/142)。
6 診斷
常用的診斷毛滴蟲病的方法有直接濕片鏡檢法、糞便培養法和PCR法。毛滴蟲滋養體對環境較敏感，其診斷對糞便樣本有較高的要求。待分析糞便必須新鮮、無污染，且測試前不要冷凍。最好采集剛排出的新鮮糞便或用糞圈或結腸沖洗技術人工提取糞便[1,6,17]。如樣本需運輸，可用鹽水(每2 g糞便用3 mL生理鹽水)稀釋，防止干燥以延長毛滴蟲存活時間。為提高檢測敏感性，糞便樣品最好在6 h內分析完畢，如超過6 h，會降低檢測敏感性[1]。非腹瀉貓的糞便或干結糞便，不適合用于毛滴蟲檢測，因即使存在感染，也很少會有陽性結果。在貓服用抗生素的情況下采樣，會降低毛滴蟲檢出率，因此在采樣前，最好提前幾天停用任何類型的抗菌治療[1]。
6.1 直接濕片鏡檢法
將少量糞便用生理鹽水稀釋后，蓋上蓋玻片，置200×或400×鏡下檢查，即“濕片”法。觀察時，可根據滋養體形狀和運動特點發現蟲體，一旦蟲體不運動或死亡，則很難檢出。該法操作簡單、成本低，但檢測敏感度較低，其中人工感染貓檢出率低于2%，自然感染貓檢出率約4%。實踐中，可用新鮮、非冷藏(凍)和腹瀉貓糞便及多次涂片檢查等提高檢出率[6]。此外，該法不能區分T.foetus和P.hominis等不同毛滴蟲蟲種，同時因T.foetus滋養體大小與賈第蟲包囊大小相似，容易混淆，鏡檢時要注意排除干擾。 對T.tenax，則直接取貓口腔刮取物，用生理鹽水稀釋、涂片后鏡檢。
6.2 糞便培養法
如糞便經多次鏡檢仍為陰性，可用商業化的In Pouch TF培養基進行蟲體培養。該法僅需少量糞便(米粒大小即可)，敏感性比直接鏡檢高，自然感染貓檢出率約55%。因賈第蟲不能在該培養基上生長，可排除賈第蟲包囊對結果的干擾[1]。但該法耗時較長，需幾天時間讓蟲體增殖以提高檢出率，且該法也不能區分不同毛滴蟲蟲種。此外，也可用Diamond或改良Diamond培養基等對糞便進行培養后檢測。
6.3 PCR方法
目前，已發展了多種檢測貓毛滴蟲的PCR方法，主要擴增的靶基因為毛滴蟲5.8S rRNA的ITS1和ITS2區。最常用的方法是巢式PCR法，第一對引物為TFR3和TFR4(擴增347 bp的片段)，第二對引物為TFITS-F和TFITS-R(擴增208 bp的片段)[18]。已證實引物對Th3/Th5是P.hominis特異的，在其基礎上發展出的單輪和巢式PCR方法是較為常用的方法[22-23]。Kikuta N等[21]發展了一種特異檢測T.tenax的PCR方法。PCR方法的敏感性和特異性均優于糞便培養法和直接濕片鏡檢法，所需時間比培養法短，且不要求必須是活蟲體，死亡蟲體也可檢測，可檢測至最低10個蟲體/100 mg糞便[22]。但因糞便成分復雜，如多糖復合物、膽鹽、血紅蛋白降解產物、酚類化合物和重金屬等PCR抑制劑常與蟲體DNA共同提取，會降低檢測的敏感性，導致出現“假陰性”[6]。
6.4 組織病理學方法
組織病理學法可作為檢測腸組織中P.hominis/T.foetus滋養體的一種診斷方法，但因滋養體極其脆弱，很難保存在活檢標本中，因此檢測結果并不準確[6]。使用該法時，對同一樣本，需檢查至少6個組織切片，以獲得至少95%的置信度[1]。免疫組織化學、熒光原位雜交與顯色雜交技術也可應用于組織標本中毛滴蟲的檢測，但不易推廣應用。
7 治療
通常治療人陰道毛滴蟲等腸道原蟲的藥物，如甲硝唑和替硝唑，在治療貓毛滴蟲病時效果不佳。羅硝唑(RDZ)是迄今唯一已證實對貓T.foetus有效的藥物，通常按每天20 mg/kg～30 mg/kg劑量口服，連用14 d[1]。在用RDZ治療期間，大多數感染貓的糞便稠度能快速改善，一般在治療2周后正常[1]。但一些結腸損傷嚴重的病例，治療數周腹瀉仍不見好轉。因從腸道徹底清除毛滴蟲難度較大，用RDZ治療后，毛滴蟲病可能會復發，但經多次治療的貓可痊愈[23]。用芬苯達唑、帕羅霉素、替硝唑和甲硝唑等治療毛滴蟲病時，治療期間，貓糞便狀況有所改善，但停藥后腹瀉經常重現[6]。有報道顯示貓毛滴蟲可對RDZ產生抗藥性，但感染貓群中抗藥性蟲株的流行情況不甚清楚[24]。高劑量應用RDZ，可使貓產生食欲減退、顫抖、虛弱、共濟失調和感覺過敏等副作用。因副作用的存在，只有在已明確確診為毛滴蟲感染的病例、且已征得貓主人同意，才建議應用RDZ治療[12]。
目前報道的其他治療貓毛滴蟲病的方法較少。許多有效治療腹瀉的辦法如改變飲食，使用不同類抗菌素、益生菌和營養補充劑等，對治療貓毛滴蟲病效果均不明顯[25]。
8 預后
貓毛滴蟲病的預后往往良好，感染T.foetus的貓仍可保持正常身體條件和生理狀態。88%的腹瀉貓，其糞便可在感染2年后自然恢復正常。平均腹瀉持續時間為135 d。然而，T.foetus感染很難自發消除，暗示貓很難對T.foetus感染產生有效的免疫反應，約54%的貓存在持續感染或再次感染，或間歇性腹瀉反復發作等，推測可能與應激或腸道菌群變化相關。此外，慢性感染可能會使部分貓發展為炎癥性腸病[6,12]。
鑒于貓毛滴蟲病預后良好，當感染發生后，治療與否成為一個必須抉擇的問題。歐洲貓科疾病咨詢委員會推薦，僅當腹瀉的貓經直接濕片鏡檢和糞便培養后鏡檢為毛滴蟲陽性時，建議進行治療[1]。很多貓感染后無臨床癥狀，但其可能成為潛在的傳染來源。因此，建議所有經檢測毛滴蟲陽性的貓，無論有無癥狀，均應進行治療，以盡量減少該病的傳播。
9 預防
因應激或免疫功能發育不成熟，在擁擠環境中飼養的小貓更易發生T.foetus感染。因此，減少應激，避免密集飼養，以盡量減少接觸或感染T.foetus的機會。此外，應對所有被T.foetus污染的貓舍、床、被褥、運輸箱、垃圾箱等進行徹底消毒，以殺死污染的滋養體[6,12]。
10 展望
貓毛滴蟲病作為一種貓的新發傳染病，已引起獸醫界的關注。目前對該病的研究遠未達到預期，尤其急需有效、安全的治療辦法。繼續開展貓毛滴蟲病的病原學、流行病學、傳播模式、致病性、人獸共患潛力等研究，有助于更全面的掌握其情況，從而為防控奠定基礎。
動物醫學論文范文 第13篇
題目：牛呼吸道疾病兩種細菌性病原研究進展
牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease，BRD)是一種由多種因素引起的綜合征，包括環境和管理相關的應激源以及多種病毒和細菌病原體，給北美和世界養牛業造成巨大的經濟損失，目前仍然是影響北美地區肉牛最常見和損失最大的疾病，也是引起奶牛發病和死亡的重要原因[1]。我國目前尚未研制防控BRD的相關疫苗，防控措施較為單一，建議深入開展致病機理及防控技術研究，開發有效的診斷試劑與疫苗，對高效防控該類疾病，保障養牛業的健康、快速、可持續發展具有重要意義[2-3]。Dubrovsky S A等[4]報道美國加州的飼養場中BRD的發病率約為75%和病死率接近50%;育肥場的發病率更高，初步估計發病率和病死率約為90%。而在奶牛養殖場中，斷奶犢牛BRD的發病率約為22%和病死率約20%，也是導致斷奶前犢牛死亡的主要原因。
BRD的發生是由多種因素引起并最終導致受感染牛表現臨床癥狀，但引起發病的細菌性病原體主要是溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)[5]。這些病原體已經適應并定植于呼吸道黏膜表面，從而逃避宿主的免疫反應;適應機制包括表達黏附素、產生和分泌毒素與蛋白酶以及形成生物膜。耐藥性是BRD病原菌中的一個新問題，而Mh廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)菌株的分離越來越普遍[6-7]。本文對引起BRD的兩種主要細菌性病原體的生物學特性、免疫逃避和致病機制、耐藥性與耐藥現狀及多重耐藥的遺傳機制，以及這些因素如何影響對此類疾病的診斷、治療和療效等進行簡要概述，以期為我國防控該病提供參考。
1 Mh與Pm概述
Mh和Pm是巴斯德菌科的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，通常定植于臨床健康牛的口咽部黏膜上。一般來說，這些微生物引起牛的臨床疾病是由應激、免疫抑制和病毒感染的共同作用導致的，最終導致其在下呼吸道的過度生長。越來越多的證據表明其具有傳染性，至少Mh可在種群內傳播[8-9]。
多殺性巴氏桿菌由5種莢膜血清型(A、B、D、E、F)和16種菌體血清型(1-16)。相比之下，溶血性曼氏桿菌至少由12種莢膜血清型(1、2、5-9、12-14、16和17)組成。對于兩種病原體，莢膜血清型是引起宿主特異性和致病性的原因。盡管存在不同的血清型，但臨床疾病多集中在莢膜血清A1型Mh(>75%的病例)和莢膜血清A3型Pm(肉牛>30%和奶牛>60%的病例)。Cozens D等[10]的研究表明，A1型Mh的特異性毒力因子促進了其在牛呼吸道上皮細胞的侵襲，使其能夠進行不受控制的復制并擴散到鄰近的細胞;一旦進入細胞，能對受感染的組織造成廣泛的損害，同樣的現象沒有在呼吸道共棲的血清型中發現[10]。
除了莢膜型外，這兩種微生物都是革蘭氏陰性菌，其特征是細胞外壁存在脂多糖(LPS)。內毒素是一種強有力的促炎介質，可觸發細胞因子的釋放，并刺激炎癥細胞的涌入，從而導致疾病的發生。此外，內毒素與白細胞毒素協同作用可以增強Mh的致病性。
2 Mh與Pm的免疫逃避和致病機理
許多革蘭氏陰性病原體已經進化出在黏膜表面定植并增強細菌與宿主相互作用的機制。隨著時間的推移，對強毒株的詳細研究使得各種影響因素為人所知，這些因素使Mh和Pm在逃避宿主免疫反應或增強臨床疾病方面沒有差異(表1)[5]。這種能力是很重要的，因為了解致病的不同毒力因子可能有助于開發出以增強對這些化合物的免疫力為中心的控制策略。
表1 溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機制和毒力因子
Mh和Pm都能產生一系列黏附素，這些黏附素允許上皮細胞附著并防止吞噬作用[5]。例如，莢膜 A型Pm的莢膜由透明質酸組成，這種莢膜增強了與呼吸道上皮細胞的結合和在下呼吸道的定植。此外，Mh產生一種纖維蛋白原結合蛋白，該蛋白包裹在細菌細胞表面，阻止補體結合，從而降低調理作用[5]。值得注意的是，這些病原微生物的其他血清型的莢膜是由與宿主組織成分非常相似的物質(如肝素、軟骨素)組成的，這可能導致它們的抗原性較差。
這些病原體還有其他幾種逃避和操縱宿主免疫系統的方法。例如，免疫球蛋白(Ig)A-特異性蛋白酶系列可以裂解IgA并阻止其與病原體結合[11]。這些蛋白酶的最終作用是防止調理作用或補體介導的殺傷。此外，Mh具有在呼吸道中形成生物膜的能力，生物膜是一種由多糖、蛋白質和DNA組成的聚合物包裹的有組織的細菌群落，是細菌適應生活在潛在的惡劣環境中的一種手段[11]。在健康的宿主中，大多數Mh可能存在于口咽和扁桃體隱窩的生物膜中。在生物膜內，細菌可以免受抗菌藥物和宿主免疫反應的影響。當病原微生物處于生物膜而非浮游狀態時，許多抗菌藥物對Mh的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)倍增[12]。此外，研究表明，宿主產生的應激性化學物質(P物質、去甲腎上腺素、腎上腺素)可以促進生物膜擴散，生物膜是一種能夠從上呼吸道向下呼吸道運動的因子，并將應激與臨床BRD聯系起來[13]。
白細胞毒素是一種由Mh產生的與臨床疾病相關的重要毒力因子，這種毒素的重要性與Mh致病性直接相關。因此，在設計Mh的控制方案時，必須首先考慮白細胞毒素的影響。白細胞毒素是毒素(repeat in toxin，RTX)家族中的重復序列，在細菌的對數生長期所有Mh均可產生[6]。白細胞毒素可特異性地與牛中性粒細胞、巨噬細胞、血小板和淋巴細胞表面的分化簇(cluster of differentiation，CD)18相互作用，一旦與之接觸，中性粒細胞就會脫顆粒并釋放有效的消化酶進入周圍組織。此外，白細胞毒素刺激組織肥大細胞的脫顆粒和血管活性介質的釋放。如前所述，內毒素和白細胞毒素具有協同作用，內毒素是一種有效的趨化劑，可使中性粒細胞和其他炎癥細胞進入呼吸道。此外，內毒素的釋放有助于CD18在炎性細胞表面的上調表達。因此，更多的細胞對白細胞毒素具有更高親和力，其存在可導致嚴重的臨床疾病發生[5]，如Mh經常與典型的纖維蛋白性胸膜肺炎的發生相關。
3 Mh與Pm的耐藥性
獸醫最關心的是細菌的臨床抗藥性，他們感興趣的是某種特定抗菌藥物能有效治療被某種特定病原體感染而導致某種疾病的動物[14]。臨床耐藥的概念是基于臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)——獸醫抗菌藥物敏感性測試委員會制定的藥敏結果解釋標準，具體如下：一是特定細菌病原體代表性群體的抗菌藥物的體外最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)范圍;二是通過藥物濃度與微生物敏感性之間的關系，建立的藥代動力學/藥效學(PK/PD)的參數;三是在目標物種中進行臨床試驗的結果[15]。
對于BRD病原體，CLSI批準了針對青霉素(僅限于肉湯稀釋法)、頭孢噻呋、達氟沙星(danofloxacin)、恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸大觀霉素、拖拉霉素(tulathromycin)、加米霉素(gamithromycin)、泰地羅新(tildipirosin)和替米考星(tilmicosin)的藥敏結果解釋標準[16];對于這些抗菌藥物，敏感性結果表明治療成功的可能性明顯大于耐藥性結果。這些藥敏結果僅適用于按照抗菌藥物使用說明進行，且藥敏試驗采用CLSI批準的方法和解釋標準的情況下，然而藥敏試驗與臨床結果之間的關系并不完善。同樣有一點非常重要，我們必須認識到抗菌藥物藥敏試驗不能保證在單個動物身上得到特定的臨床結果。試圖通過體外測試獲得的藥敏結果來推斷體內反應，疾病結果通常受到諸如宿主免疫狀態、個體藥代動力學參數變化或疾病嚴重程度增加/病程延長等因素的影響。對于沒有CLSI批準的藥敏結果解釋標準的抗菌藥物，已從其他物種的血漿和組織液中推斷獲得，例如青霉素G(紙片擴散法)、四環素(紙片擴散法)、強化磺胺類藥物、氨基糖苷類藥物和紅霉素等藥物[17]。對于這些抗菌藥物而言敏感結果優于耐藥性結果，但是目前尚無相關數據可將敏感性測試結果與牛BRD的預期結果相關聯。
第二種耐藥性是根據監測細菌野生型種群中藥物敏感性分布特征變化的數據進行定義的[18]。這些流行病學臨界值沒有提供與臨床結果相關的數據，而是代表了MIC與原始細菌種群的偏差，可以用來指示耐藥性決定因素的出現。因此，流行病學臨界值可能表明MIC的耐藥性與臨床藥敏結果解釋標準有所不同(通常更低)。此外，盡管文中提到的許多研究可能涉及多種抗菌藥物，但僅討論CLSI已建立敏感性結果解釋標準的藥物;病原體為Mh、Pm和睡眠嗜血桿菌(Histopilussomni，Hs)，抗菌藥物為頭孢噻呋、達氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、加米霉素、青霉素、大觀霉素、四環素、泰地羅新、拖拉菌素、替米考星(僅適用于Mh)。
4 Mh與Pm的流行率與耐藥模式
最早建立的Mh與Pm的MIC分布是利用現代實驗室診斷方法和CLSI批準的藥敏結果解釋標準，通過對1988年至1992年期間死于BRD的動物調查得出的[19];在這項研究中，對美國和加拿大20多個州的461株Mh和318株Pm菌株進行MIC測定，結果表明Mh和Pm分離菌株100%對頭孢噻呋敏感，83.5%和83.3%對大觀霉素敏感，57% 和70.5%對四環素敏感，69.1%和未測試對替米考星敏感。值得注意的是，研究中使用的替米考星的解釋標準在Mh與Pm上均未通過驗證;按照目前公認的標準，使用該藥物的耐藥性將顯著降低(>90%敏感)。對1994年至2002年俄克拉荷馬州死于BRD的肉牛肺中分離獲得的390株Mh和292株Pm耐藥性進行研究，結果表明四環素和大觀霉素的敏感性各不相同且較低，氟苯尼考和替米考星與頭孢噻呋和恩諾沙星的結果正好相反，敏感性很高且相對穩定[20]。對2000年至2009年間美國和加拿大收集的Mh(n=2 977)和Pm(n=3 291)分離株進行藥物敏感性評估，結果顯示頭孢噻呋對兩種病原體均保持高度敏感且一致(100%敏感)，對達氟沙星、恩諾沙星和氟苯尼考的敏感性隨時間的推移保持穩定，而對替米考星和拖拉菌素的敏感性均下降[21]。一項來自堪薩斯州立大學的對細菌多重耐藥性和共同耐藥模式的研究，被認為具有里程碑意義，該研究評估了2009年至2011年期間從患有BRD的牛肺部分離的Mh分離菌株;研究結果表明分離株對5種或5種以上抗菌藥物的耐藥性比例從5%增加到35%，對土霉素或替米考星耐藥的菌株，至少對另外1種抗菌藥物的耐藥性明顯更高[22]。
研究人員對到達和離開育肥場的牛就抗菌藥物的耐藥性進行了多項研究。Klima C L等[23]對阿爾伯塔省南部2個飼養場，在進入時和離開前30 d內選取30%圈舍采集10%的動物鼻拭子樣本，用于Mh的分離和藥敏試驗，獲得了409株Mh，藥敏結果顯示對所有抗菌藥物的耐藥性從0.2%到3.9%不等且都很低，其中對土霉素普遍耐藥;值得注意的是，該研究中許多被評估的抗菌藥物，CLSI沒有明確由Mh引起的BRD的藥敏結果解釋標準，這使得研究中的一些結論難以解釋。Noyes N R等[16]對加拿大4個飼養場按照到達時和離開前的一個時間點，采集深部鼻咽(deep nasopharyngeal，DNP)拭子，獲得2 989株Mh，評估21種不同抗菌藥物的敏感性，耐藥性很少見，87%的菌株對所有抗菌藥物都敏感。值得注意的是該研究與Klima的相似，許多被評估的抗菌藥物， CLSI沒有解釋標準。一項來自加拿大的研究評估了從健康和患有BRD的牛身上分離出Mh的耐藥模式， 18%的分離菌株具有耐藥性[17]。總的來說，收集于BRD牛的分離株(32%)比健康牛 (2%)更容易產生耐藥性。分離菌株普遍對四環素耐藥，一般來說，如果分離株對一種藥物耐藥，它也至少對一種其他的抗菌藥物耐藥[17]。
Snyder E等[7]評估了使用長效大環內酯類藥物拖拉霉素預防Mh耐藥性的流行情況，取得了令人驚訝的結果。犢牛在進入育肥場之前被給予拖拉霉素以防止BRD發生，在抵達當天采集DNP拭子，10 d～14 d后再采集1次。結果表明與在抵達時相比，對于除頭孢噻呋外的所有抗菌藥物，第二次被劃分為中介或耐藥的分離株比例顯著增加。第二次藥敏結果顯示0.8%表現為敏感， 24.4%對2種抗菌藥物(氟喹諾酮類和大環內酯類)中介或耐藥， 74.8%對3種抗菌藥物(氟喹諾酮類和大環內酯類以及酚類或頭孢菌素類)表現為中介或耐藥[7]。評估恩諾沙星和拖拉菌素在治療和預防犢牛BRD中的療效和耐藥性時得出了與Snyder類似的結果。Woolums A R等[18]進行的相關研究也得出了類似的結果，使用大劑量泰地羅新進行藥物治療后采集DNP拭子，分離鑒定的Mh分離株幾乎對除頭孢噻呋外的所有藥物均具有耐藥性，且100%屬于多重耐藥(multidrug resistance，MDR)。
綜上所述，許多有關BRD主要細菌性病原體耐藥性的研究工作都來自飼養場和育肥場。而在養殖場中，關于耐藥性的研究相對較少。來自瑞士的Pipoz F等[19]收集了來自52個奶牛群的中犢牛臨床樣本，對樣本中Mh和Pm分離菌株的耐藥流行情況進行了研究。結果表明Mh(n=8)分離菌株對四環素、恩諾沙星、青霉素、頭孢噻呋、大觀霉素和氟苯尼考敏感;相比之下，Pm(n=37)分離菌株對恩諾沙星、頭孢噻呋、大觀霉素和氟苯尼考敏感，但對替米考星呈現中介，對四環素呈現耐藥。Owen J R等[20]評估了美國加利福尼亞的一個育肥場和飼養場采集的犢牛鼻拭子中分離出的Mh和Pm菌株耐藥性的流行情況，結果顯示Mh和Pm分離株對頭孢噻呋和恩諾沙星敏感，其中大多數Pm分離株對青霉素和托拉菌素敏感，超過50%對達氟沙星耐藥，30%對氟苯尼考耐藥，90%以上的對四環素和替米考星耐藥;所有的Mh分離株均對大觀霉素敏感，20%對達氟沙星、拖拉菌素和氟苯尼考耐藥，30%對替米考星耐藥，有60%對青霉素耐藥。一項來自Snyder E等[5]的最新研究，收集了加利福尼亞一個牧場的100頭診斷為BRD的奶牛樣本(經鼻腔清洗、支氣管肺泡灌洗液的DNP拭子)，對樣本中分離的Mh(n=53)和Pm(n=175) 進行了藥物敏感性評估，結果顯示多數Pm(>90%)分離菌株對氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素、大觀霉素和托拉菌素敏感，但對恩諾沙星和氟苯尼考耐藥;相比之下，大多數Mh (>90%)對氨芐西林、頭孢噻呋、青霉素和氟苯尼考敏感，對恩諾沙星和大觀霉素中介，對拖拉菌素耐藥。
5 多重耐藥的遺傳機制
上述表明BRD是主要細菌性病原體，特別是Mh的耐藥性正在增加，廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)Mh的分離也越來越普通。所以，問題是只接觸一種藥物后，如何產生對多種抗菌藥物的耐藥性?通常是水平基因轉移導致了抗藥性的迅速增加。水平基因轉移有3種不同的方式：(1)通過轉化從環境中所謂的外源DNA中獲取基因;(2)通過轉導由噬菌體轉移遺傳物質;(3)通過獲取可移動的遺傳元素[21-22]。雖然這3種機制都可以在獲得耐藥性中發揮作用，但在Mh和Pm中，多重耐藥(multidrug resistance，MDR)菌株增加的主要驅動因素似乎是獲得一種稱為整合共軛因子(integrative conjugative element，ICE)的移動遺傳元件[23]。ICE是整合到宿主染色體中的移動遺傳元件，然后可以將它們繁殖并傳給后代，但也可以自我切割，以環狀中間體的形式復制，并通過Ⅳ型分泌系統轉移到其他鄰近細胞，最終整合到新宿主的染色體中[22]。ICE中通常還帶有其他載體基因包括抗藥性基因，受體細胞正是隨著ICE轉移的這種方式迅速獲得了多種抗藥性基因[24]。
Mh和其他與BRD相關的巴氏桿菌科中已記錄了大量不同的ICEs。Pm(ICE-Pmu1)中鑒定出第一個攜帶四環素、氟苯尼考、磺酰胺、大觀霉素、恩諾沙星、替米考星和拖拉霉素抗性的ICE基因。 Eidam C等[25]在Mh 菌株42548中發現鑒定出第一個ICE基因是ICEMh1，該ICE基因比ICEPmu1長但缺少一些基因，這些基因賦予了ICEPmu1對相同數量的抗藥性基因。
2014年Klima C L等[23]對來自Mh、Pm和Hs的25個ICEs進行了鑒定。在采集自喬治亞州肉牛育肥場的Mh分離菌株中發現了3個ICEs(命名為UGA1，UGA2，UGA3)，這些ICEs的長度各不相同，但與ICEMh1和ICEPmu1具有同源性;ICEMh-UGA1和ICEMhUGA2的前1/4與ICEMh1相似，而其余3/4與ICEPmu1相似。此外，這些ICEs攜帶的所有抗性基因與存在于ICEPmu1中的相同，但ICEMh-UGA2中不含有floR基因(對氯霉素類藥物具有抗性的基因);與鑒定出的其他兩種ICE不同，ICEMh-UGA3僅攜帶tetH/R抗性基因復合體(該復合體編碼對四環素類抗生素的抗性基因)。
ICEs中存在的耐藥基因將對多種類型、具有抗菌作用的大量抗菌藥物產生抗性。在Mh分離株攜帶的β-內酰胺抗性基因中，最常見的是blaOXA-2，其次是blaROB-1(盡管該基因攜帶在不依賴于ICE的質粒上的可能性較大，就像最近發現的blaROB-2基因)[8,23,26-27]。所有這些編碼超廣譜β-內酰胺酶的基因，不僅對經典的青霉素類藥物，而且對較新的廣譜頭孢菌素類藥物都具有抗性[27]。已知所有這些基因均可傳遞對氨芐青霉素和青霉素的耐藥性，并可能增加頭孢噻呋的MIC[23,28]。不過，這些基因的存在可能不會自動導致抗性，因為已知這些基因會產生導致基因失活的點突變[29]。
Mh和Pm對氯霉素類抗生素的耐藥性通常是由floR基因的存在引起的[23]。該基因編碼一種藥物外排轉運蛋白，它能主動地將氯霉素類抗生素泵出細胞。然而在某些情況下，floR并不能使Mh和Pm產生完全的抗性而是將MIC調整到中間范圍，這可能是因為這些微生物中基因的活性降低。tet類基因是編碼四環素的最常見抗性基因，這些基因可調控外排泵將四環素主動泵出細菌細胞。在Mh和Pm中，tetH、tetB、tetL和tetG是編碼這種泵的最常見基因，它們可以在質粒和細菌染色體中找到[30]。但是在Mh和Pm的ICEs中僅發現并記錄了tetH基因[23,25]。在這些ICEs中通常還存在一個tetR基因(有時是重復的)，它充當tet基因對四環素濃度敏感的轉錄調節因子[23,25,31]。
大環內酯類藥物廣泛應用處于高風險的BRD牛身上[32]。erm42、msrE和mphE基因是Mh和Pm ICE中最常見的大環內酯類耐藥基因，它們以不同的方式對這類抗菌藥物產生耐藥性。研究表明erm42基因編碼一個單甲基轉移酶，該轉移酶在23S核糖體亞基上的A2058核苷酸處添加了一個甲基基團，從而導致對林可酰胺類藥物的耐藥性，以及對低濃度大環內酯類和鏈霉素類抗生素具有耐藥性。msrE基因編碼大環內酯類外排泵，對14元和15元環大環內酯類藥物如紅霉素、拖拉菌素和加米霉素產生耐藥性;然而，它不產生對16元環大環內酯類藥物的耐藥性，如泰樂菌素、替米考星和泰地羅新。mphE基因是一種大環內酯類磷酸轉移酶，在傳遞抗菌藥物耐藥性的方面與msrE具有相似的作用機制。隨著時間的推移，磺胺類藥物在治療牛病上的療效逐漸下降，伴隨著新抗菌藥物的出現其使用量越來越少。sul1和sul2基因是革蘭氏陰性菌對磺胺類藥物的主要耐藥基因，它們是通過編碼一種耐藥的二氫葉酸合成酶來起作用的。到目前為止，在Mh和Pm中僅發現sul2基因和ICE相關。ICE中存在的其他基因有aadA25、aadB、strA和strB以及aphA1，這些基因編碼對氨基糖苷類抗生素的抗性。aadA25(ant3〃)通過編碼氨基糖苷類O-核苷酸轉移酶促進對氨基糖苷大觀霉素和氨基糖苷鏈霉素的耐藥性。aadB(ant2〃)也編碼氨基糖苷O-核苷酸轉移酶，但對慶大霉素、妥布霉素、地貝卡星(Dibekacin)、西索米星(Sisomicin)和卡那霉素產生耐藥性。strA(aph3〃)、strB(aph6)和aphA1(aph3′)是抗性基因，其編碼修飾和使氨基糖苷失活的氨基糖苷O-磷酸轉移酶。strA和strB均對鏈霉素產生耐藥性，而aphA1則對卡那霉素、新霉素、巴龍霉素(paromomycin)、核糖霉素和利維霉素(lividomycin)產生耐藥性。
導致Mh分離菌株XDR株流行率上升的因素可能是攜帶多種基因，這些基因對目前用于預防和治療BRD的大多數抗菌藥物產生耐藥性。重要的是由于牛呼吸道病原體具有XDR的性質，接觸一種抗菌藥物不再僅僅是選擇對這一種抗菌藥物的耐藥性。耐藥性現在是一種多藥現象，接觸一種抗菌藥物中會選擇對其他多種相關和不相關的抗菌藥物產生耐藥性。關于BRD病原體耐藥性的另一個重要因素，就是耐藥性的增加很大程度上是由眾多MhXDR菌株所攜帶的ICE導致的[8]。抗菌藥物導致XDR菌株的擴增和繁殖，以及隨后該菌株基因組中攜帶的所有基因和突變。因此，如果動物被診斷出患有BRD并接受了一種特定的抗菌藥物治療，那么該動物隨后不僅會攜帶對該抗菌藥物具有耐藥性的分離株，而且會對該動物分離株ICE所攜帶的其他所有抗菌藥物具有抗性，因為不同的基因之間存在聯系[7,9]。此外，由于XDR Mh菌株也含有對氟喹諾酮類抗菌藥物產生耐藥性的突變，盡管該基因/突變未攜帶在ICE上，但對此類抗菌藥物的仍將呈現耐藥表型[8,18]。重要的是，有新的證據表明這些菌株可能通過牛犢之間的接觸以及暴露于受污染的環境，在具有感染風險的牛群中傳播[8-9,16]。因此，了解XDR，重要的是不要僅僅局限于治療過的動物;相反，有可能會在與治療動物使用但從未接觸過抗菌藥物的動物身上發現XDR克隆[16]。
6 抗菌藥物耐藥性對治療結果的影響
首次治療成功的定義是在第一次應用抗菌藥物治療效果顯著的動物比例。在大多數育肥牛飼養場中首次治療成功的比例都很高。通常，大于80%的首次治療成功比例被認為是可以接受的。但是，Avra T D等[33]對引起治療失敗的風險因素進行評估和回顧性研究發現，超過30%的牛對首次治療沒有反應，而且暴露于高風險感染狀態比低風險狀態的犢牛首次治療失敗的可能性大。但是關于耐藥性對患BRD牛臨床預后的影響很少有人評估，Mcclary研究表明處于易受Mh分離株感染中的牛群 62%(n=688)對替米考星治療有反應，但是38%(n=6)的牛攜帶耐藥菌株。
7 結語
在臨床治療中必須認識到毒力因子和抗菌藥物耐藥性，并在制定以這些病原微生物為中心的治療和控制方案時考慮這些因素。盡管BRD對北美乃至世界養牛業具有重要意義，養牛業發達國家包括我國在內的研究人員很少有經過精心設計的研究來評估引起BRD重要細菌性病原體的抗藥性。現在發表的多數文獻均是來自于經過多次不同抗菌藥物治療的病死牛樣本中獲得實驗診斷報告，且這些動物已經用多種不同的抗菌藥物進行了多次治療。以Mh為例，總體趨勢表明，隨著時間的推移敏感性降低了，臨床耐藥菌株在逐漸增加。近年的研究表明，某些牛場中常見的抗菌藥物使用方法可能是促使耐藥克隆增加的主要因素。在科研人員做好流行病學、病原分離鑒定、致病機理、耐藥性與免疫防控研究的基礎上，廣大從事具體養殖的牧場主和從業人員，應將重點放在養殖場生物安全防控、減少應激、增強免疫功能和抗菌藥物管理上，將有助于成功控制由這些微生物引起的疾病綜合征，減少由此產生的負面影響和經濟損失，促進養殖健康可持續發展。
動物醫學論文范文 第14篇
題目：豬流行性腹瀉病毒入胞機制研究現狀
豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)α冠狀病毒(Alphacoronavirus)。該病毒主要感染豬腸道上皮，導致絨毛萎縮、吸收不良，引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和高病死率。PEDV主要通過糞-口直接接觸傳播，也可形成氣溶膠并通過糞-鼻途徑傳播[1]。
豬流行性腹瀉在20世紀70年代后期首次出現在英國和比利時[2]。我國于1973年首次報道豬流行性腹瀉病例;隨后，包括韓國和日本在內的其他亞洲國家也相繼暴發該病[2]。2010年10月之后我國開始大規模暴發該病[2]。目前，PEDV已成為亞洲仔豬腹瀉的主要原因，是世界上最嚴重的豬病毒性疾病之一，給生豬行業的發展產生了巨大影響，造成了重大經濟損失。
本文主要針對國內外近期在PEDV的組織和細胞嗜性、細胞受體、入胞方式、細胞蛋白酶方面的研究進展進行綜述，以期為后續PEDV的研究提供參考。
1 PEDV的組織和細胞嗜性
病毒在特異組織和細胞中的復制能力是決定其組織嗜性的重要因素。PEDV在腸道具有組織嗜性，哺乳豬感染急性PEDV的12 h～24 h內，PEDV主要感染空腸和回腸，其次是空腸近端和十二指腸[3]。幽門不是急性PEDV感染的部位，而大腸的絨毛腸細胞經常被感染，但感染的結腸上皮細胞無壞死病變。與結腸腸上皮細胞不同的是，PEDV感染的小腸絨毛腸上皮細胞會發生急性壞死并從固有層剝落，導致小腸中明顯的絨毛萎縮或融合[1]。PEDV可能不會在體內誘導腸道絨毛腸細胞凋亡，但體外感染PEDV的非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)會發生凋亡[1]。
PEDV感染早期定位在小腸的絨毛-隱窩界面，而不是在絨毛尖端中。PEDV最先感染未成熟的腸細胞，隨后感染至空腸上部，直至感染整個空腸的絨毛上皮[1]。除了通過糞-口傳播，PEDV還能夠經過鼻腔黏膜下的樹突狀細胞的攝取進入鼻腔黏膜固有層，隨后攝取PEDV后的樹突狀細胞遷移至附近淋巴結，通過病毒突觸將PEDV傳遞給淋巴細胞，而后攜帶PEDV的淋巴細胞又能經淋巴循環和血液循環遷移至腸黏膜，并將病毒傳遞給腸上皮細胞引起致病[3]。PEDV在體內除主要感染豬小腸上皮細胞外，還感染杯狀細胞和隱窩干細胞[4]，也能夠在仔豬鼻腔上皮中進行低水平復制[3]。
PEDV的S蛋白既具有受體結合能力又具有膜融合能力，S蛋白是決定組織和細胞嗜性以及宿主范圍的關鍵因素，但PEDV的細胞適應性差。自PEDV發現以來，科研人員嘗試了很多方法將病毒適應于細胞培養。1984年宣華等首次報道了在胎豬腸組織單層細胞上培養PEDV，但因胎豬腸組織不易獲得，未得到廣泛應用。直到1988年，Hofmann等通過向Vero細胞培養基中添加胰蛋白酶，使PEDV成功適應于Vero細胞。其后，日本和韓國也相繼報道PEDV在Vero細胞上培養成功。我國李樹根、錢永清等也成功地在體外實現PEDV的細胞培養。
目前PEDV的分離培養多數需要在細胞培養基中添加胰蛋白酶，可能是由于蛋白酶在PEDV侵入細胞和細胞釋放PEDV病毒粒子方面起著重要作用。但是，不同來源的PEDV或Vero細胞適應株對胰酶的抵抗力不一致，有的病毒經過高代次傳代培養后已不具備胰酶依賴性。研究發現，胰蛋白酶通過將S蛋白切割為S1和S2亞基，使PEDV能夠在體外復制[5]。胰酶識別切割S蛋白的裂解位點在S2區的890位氨基酸，裂解后的S2可以促進病毒與宿主細胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。隨后，PEDV可使受感染細胞裂解，導致細胞膜空泡化和合胞體形成[7]。
適應Vero細胞的PEDV可以在不同種類的細胞系中增殖。Liu等將仔豬中分離的PEDV Ohi VBS2株在Vero CCL-81細胞中進行適應性培養，隨后用該細胞適應的PEDV分別感染PK-15、豬睪丸細胞(swine testicle，ST)、人肝癌細胞(human hepatocellular carcinomas，Huh-7)、人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblasts，MRC-5)、Vero CCL-81和蝙蝠肺細胞(bat lung，Tb1-Lu)等，結果發現Vero CCL-81細胞適應的PEDV可以感染上述細胞系，提示PEDV能夠感染豬源、猴源、人源及蝙蝠源的細胞系[8]。結合基因組進化分析結果，推測PEDV可能來源于蝙蝠并且對包括人在內的其他物種都有潛在的感染能力[8]。為探索新的培養方法，研究人員利用仔豬小腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)成功分離了PEDV流行株，通過與Vero細胞對比發現病毒在添加胰酶的IEC上適應細胞能力更強，并可以穩定傳代[9]。推測可能是由于仔豬小腸上皮細胞是PEDV感染的宿主細胞，含有大量PEDV結合受體，例如pAPN等[10]。此外，IEC上的小腸宿主蛋白酶，可能具有類似胰酶的特性，可以促進病毒的侵入和增殖，提高PEDV體外培養的適應性。
2 PEDV的受體
病毒通過吸附、侵入、脫殼、合成、裝配、釋放等環節完成增殖，病毒黏附到細胞膜上是侵入宿主細胞的第一步，一般是與細胞表面的特異性受體結合。冠狀病毒的受體包括多糖類受體和蛋白多肽類受體，其中多糖類受體又包括硫酸乙酰肝素和唾液酸。唾液酸有神經氨酸 Neu5Gc、Neu5Ac、Neu5、9Ac2等;蛋白多肽受體有氨基肽酶N (aminopeptidase N，APN)、血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、癌胚抗原相關細胞黏附分子-1(carcinoembryonic antigen-associated adhesion molecule 1， CEACAM1)和二肽酰肽酶4(dipetidyl peptidase 4，DPP4)等[11]。研究發現，APN可能是PEDV的功能受體[8,10]，而Neu5Ac作為輔助受體發揮作用[8]。
氨基肽酶N(APN)是一種海馬型鋅-氨基肽酶，具有鋅離子依賴性，以頭對頭的同源二聚體形式錨定于細胞表面。APN的活性位點和肽結合通道位于一寬開口的腔中，空腔可能會進一步開放，以結合暴露的蛋白質N末端。活性位點錨定在肽/蛋白質的N-末端中性殘基，并且肽結合通道以不依賴序列的方式結合其余的肽/蛋白質。APN暴露的外表面可與冠狀病毒結合，但不會影響其生理功能，從而充當冠狀病毒受體。哺乳動物的APN多表達于腸上皮或神經系統等組織的細胞表面，是一種具有多種功能的二聚體細胞表面胞外酶。
關于豬源APN(porcine aminopeptidase N，pAPN)是否為PEDV的受體，一直存在爭議。Li B X等[10]利用PEDV分別感染非易感細胞犬腎細胞(Madin-Daby canine kidney cells，MDCK)和過表達pAPN的MDCK細胞，發現PEDV能夠在pAPN過表達的MDCK細胞生長，初步確定pAPN為PEDV的功能性受體。此外，通過建立表達pAPN的轉基因小鼠模型，發現其對PEDV易感，進一步證明pAPN為PEDV的受體[12]。但是PEDV無法在天然表達pAPN的ST細胞中復制，而后者卻對TGEV非常敏感。因此，有人推測認為，pAPN表達水平與PEDV感染之間可能存在相關性。進一步研究表明，pAPN受體密度似乎是導致PEDV感染成功的重要因素[13]。Liu C等[8]利用PEDV S蛋白假病毒系統發現，該假病毒能感染表達人源APN(hAPN)或pAPN的非易感細胞MDCK，表明PEDV與APN的相互作用不具有物種特異性。而且，PEDV能感染豬、猴、人、蝙蝠等物種的細胞系[8]，也進一步表明PEDV與APN的相互作用并不是特異的，提示PEDV可以跨物種傳播。
近年研究發現，hAPN和pAPN可能不是PEDV的主要功能受體，APN可能通過其蛋白酶活性促進PEDV感染，但PEDV感染豬小腸上皮細胞可能與pAPN不相關[7,14]。另外，PEDV可以感染Vero細胞，但Vero細胞上的PEDV受體需要進一步確認。Ji C M等利用CRISPR/Cas9技術敲除Vero細胞的APN基因后，發現APN敲除的細胞系與正常的Vero細胞感染效率相同，而且構建的穩定表達綠猴APN的Vero細胞系感染PEDV的效率也未見增加，表明Vero細胞上可能存在其他類型的PEDV受體[7]。使用肝素作為競爭劑，發現肝素預處理PEDV時，可有效地抑制PEDV感染Vero細胞的效果，推測硫酸乙酰肝素可能是PEDV感染Vero的黏附因子，也可能是Vero細胞對PEDV易感的原因之一。此外，Vero細胞本身是干擾素缺陷型細胞且具有抗高濃度胰酶的特性，也可能是PEDV易感的另一個原因，這也進一步提示pAPN不是PEDV的唯一受體。因此，PEDV可能通過不同受體感染宿主細胞。
唾液酸是帶負電荷單糖，普遍存在于細胞膜表面，唾液酸有很多病毒結合糖蛋白和糖脂的唾液酸寡糖，由于細胞外表面上糖鏈中唾液酸分子的介導使病毒進入細胞。除了APN，有研究表明PEDV S1的N末端具有唾液酸結合活性，S1 NTD與細胞表面的唾液酸結合能增強病毒的感染性[15]。通過聚糖陣列篩選，發現Neu5Ac與PEDV S1的結合親和力最高[16]。然而，尚不知道唾液酸與S蛋白的結合如何影響PEDV進入細胞。
3 PEDV入胞方式
多數病毒的表面蛋白能夠特異性地識別和結合細胞膜表面的受體，進而介導病毒的入胞[11]。有囊膜的病毒能直接與細胞膜發生膜融合，進而將病毒基因組釋放到宿主細胞質中;多數囊膜病毒是通過宿主細胞的內吞作用，將病毒顆粒包裹在內吞小體中并進入細胞。在內吞小體中，病毒囊膜與內吞小體的膜結構在蛋白酶和低pH環境下發生病毒囊膜-內體膜融合，使病毒基因組釋放到宿主細胞質中。病毒利用的內吞途徑包括網格蛋白介導的內吞、小窩蛋白介導的內吞、脂筏介導的內吞和巨胞飲作用等。
2014年，Park J E等[17]利用化學抑制劑和共聚焦方法分析了PEDV侵入Vero細胞的機制，發現PEDV的入胞過程是在網格蛋白介導的內吞作用之后發生的，并且依賴于低pH才能成功進入細胞。Wei X N等[18]用不同的PEDV亞型(PEDV GⅠ亞型GDS09株和GⅡ亞型GDS01株)分別感染Vero和IPEC-J2細胞，發現PEDV可以通過網格蛋白介導的內吞、小窩蛋白介導的內吞和脂筏介導的內吞途徑進入Vero和IPEC-J2細胞，而且不同亞型PEDV的侵入效率因內吞途徑不同而不同。進一步分析發現，不同PEDV亞型之間的差異可能是由于S基因的差異，尤其是S基因的S1區(同源性約為92 %)與受體結合效率的不同而導致細胞進入和膜融合效率的不同[19]，提示PEDV的刺突蛋白在介導不同方式的內吞途徑中各有重要作用。進一步研究發現，PEDV主要通過內吞途徑進入內吞小體，在低pH環境和組織蛋白酶L的水解作用下引發病毒表面蛋白構象的改變，從而發生病毒囊膜-內體膜融合以及病毒脫衣殼，釋放病毒基因組進入細胞質[19]。
關于PEDV侵入細胞的途徑，就目前研究結果來看，可能與豬德爾塔冠狀病毒的入侵方式類似[20]。一是內吞途徑，通過宿主細胞的內吞作用，將病毒顆粒包裹在內吞小體中并進入細胞。在內吞小體中，病毒囊膜與內吞小體的膜結構在組織蛋白酶L、低pH環境下進行融合，使病毒基因組釋放到宿主細胞質中[19]。二是膜融合途徑，通過外源蛋白酶或宿主蛋白酶在病毒和受體結合后激活S蛋白，然后病毒通過膜融合方式進入細胞質中。
4 蛋白酶在PEDV感染中的作用
蛋白酶在病毒感染中起關鍵作用，不同的病毒與不同的蛋白酶相互作用從而進入細胞，這在某種程度上決定了病毒的侵入途徑。一般來說，主要有4種細胞蛋白酶參與冠狀病毒的感染過程。
4.1 膜結合蛋白酶
大量研究表明，跨膜絲氨酸蛋白酶在病毒與細胞受體結合后介導病毒侵入。絲氨酸蛋白酶可以激活很多呼吸道冠狀病毒的感染過程。Shirato K等發現跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)可以顯著促進PEDV在穩定表達TMPRSS2的Vero細胞中釋放病毒粒子[21]。Shi W等[22]通過對Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族的TMPSS2、鱗癌細胞差異表達蛋白酶1(differentially expressed squamous cell carcinoma gene 1，DESC1)、呼吸道胰酶樣蛋白酶(human airway trypsin-like protease，HAT)和鑲嵌式長型絲氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form，MSPL)蛋白酶進行分析，結果發現TMPSS2和MSPL可與PEDV S蛋白進行共定位，且這些蛋白酶可以裂解S蛋白、促進病毒與細胞的融合。Shi等分別建立了穩定表達TMPRSS2和MSPL的Vero/TMPRSS2和Vero/MSPL細胞系，結果發現這兩種細胞系(尤其是Vero/MSPL)可以代替外源胰蛋白酶用于體外培養PEDV，它們通過激活PEDV S蛋白可以顯著提高病毒滴度，促進病毒-細胞之間的融合[23]。
4.2 組織蛋白酶
病毒與細胞融合進入內吞體后，溶酶體組織蛋白酶L或組織蛋白酶B即可激活病毒侵入。組織蛋白酶對SARS-CoV-2、MERS、HCoV-229E、SARS等冠狀病毒均有激活作用[24-26]。利用PEDV S蛋白假病毒系統發現，PEDV侵入細胞并不依賴于前蛋白轉化酶或細胞表面蛋白酶，而是被溶酶體半胱氨酸蛋白酶(組織蛋白酶L和組織蛋白酶B)激活從而裂解S蛋白，促進S蛋白包裝的假病毒粒子侵入宿主細胞[27]。同時，組織蛋白酶激活PEDV侵入的效果優于胰蛋白酶，而當組織蛋白酶被抑制或缺少時，胰蛋白酶則可以替代組織蛋白酶的作用，激活PEDV侵入[27]。
4.3 細胞外蛋白酶
胰蛋白酶是一種消化酶，主要分布在小腸中，可直接裂解許多腸道冠狀病毒的S蛋白，因此，對PEDV侵入具有一定的促進作用。研究發現，大多數PEDV毒株都高度依賴胰蛋白酶。當病毒與其受體結合時，胰蛋白酶可切割結合的PEDV S蛋白，而游離病毒顆粒不會被裂解[28]。這些發現表明，PEDV S蛋白在與受體結合并被外源胰蛋白酶切割后可能發生構象變化，從而誘導膜融合[28]。有研究表明，胰蛋白酶識別S蛋白的裂解位點為S2區的890位氨基酸，S蛋白的裂解可以促進病毒與宿主細胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。但是一些PEDV的Vero細胞適應株在感染細胞時并不需要胰蛋白酶，而病毒出芽階段經胰蛋白酶處理可在感染的細胞中引起明顯的細胞病變作用，導致感染的Vero細胞形成合胞體，在此過程中胰蛋白酶可以增強其感染性和CPE的形成[28-30]。
4.4 前蛋白轉化酶
弗林蛋白酶(Furin)是一種前蛋白轉化酶，位于反式高爾基體網絡(Trans Golgi Network，TGN)中，也存在于細胞表面。弗林蛋白酶可以裂解具有特定基序的前體蛋白，以產生具有生物學活性的成熟蛋白。該酶可以在PEDV的S1/S2位點上切割S蛋白，這種切割對于S蛋白介導的細胞-細胞融合和宿主細胞入侵至關重要。研究人員通過將PEDV S蛋白中的第888位氨基酸(V888)突變為弗林蛋白酶識別的裂解位點(VQKR→RQKR)，構建融合肽N端帶有弗林蛋白酶切割位點的重組PEDV毒株PEDV-SFCS，結果發現PEDV-SFCS可在培養細胞中復制，且不依賴胰蛋白酶，但是重組病毒的滴度較低[31]。表明宿主蛋白酶可能具有替代胰蛋白酶的潛力，如果能合理利用可以使得PEDV體外培養無需胰蛋白酶。
5 展望
PEDV刺突蛋白S決定了病毒的多樣性和宿主嗜性，并介導病毒與宿主細胞的表面特異性受體結合和病毒-細胞膜融合過程;S蛋白還與PEDV的體外生長適應情況和體內毒力衰減有關。隨著PEDV突變株的不斷產生，PEDV的入胞過程可能進化出多種機制，而且PEDV可能對包括人類在內的其他物種構成潛在威脅。值得注意的是，PEDV進入宿主細胞的途徑可能與所使用的細胞系和環境條件也有一定關聯，因此，利用豬腸小體建立的PEDV感染模型有可能會更好的模擬PEDV體內感染的過程[32-33]，而如何提高PEDV體外培養對細胞的適應性，進而提高病毒滴度，是研究者們關注和急需解決的重要問題之一。因此，構建不依賴于胰蛋白酶的通用的PEDV細胞系，對于PEDV的分離培養、病毒生物學研究，防御病毒感染至關重要。對于PEDV S蛋白與pAPN受體的深入研究將有助于更好地了解病毒入胞機制。PEDV入胞機制的深入研究，也將為靶向入胞途徑的抗病毒藥物設計提供靶點，并為PEDV的防控提供了新的思路和方向。
動物醫學論文范文 第15篇
題目：兔斯氏艾美耳球蟲病研究進展
兔球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲寄生于兔的腸道或膽管上皮細胞內引起的一種寄生蟲病。隨著規模化養兔的發展，兔球蟲病的危害在近些年逐步顯現，對我國養兔業的發展造成很大影響。在目前公認的感染兔的11種艾美耳球蟲中，斯氏艾美耳球蟲(E.stiedai)致病性較強、危害較大，且是唯一寄生在兔肝膽管上皮細胞內的兔球蟲。
1 病原形態特征
斯氏艾美耳球蟲卵囊一般為長卵圓形或近似橢圓形，卵囊大小為36.4 μm(31.3 μm～38.7 μm)×22.8 μm(19.1 μm～27.8 μm)，卵囊指數為1.59，不同地區分離株大小有一定差異[1]。卵囊一般呈淡黃或橘黃色，在較小一端往往呈削平狀或凹陷，卵囊壁非常薄、整體上光滑均厚，成熟卵囊內沒有外殘體，有些卵囊存在散在顆粒狀外殘體，但因為孢子囊的遮擋而很難被看到。孢子囊為長卵圓形，一端有斯氏體，內殘體明顯。子孢子的寬端有一折光體位于核后，呈球形，約占子孢子縱長的1/3～2/5。
2 生活史
斯氏艾美耳球蟲是少數幾種寄生在肝臟膽管上皮細胞內的球蟲之一，它的發育過程可分為裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3個階段。家兔食入孢子化卵囊后，經過腸道中膽汁和胰酶的作用，子孢子從卵囊中逸出，進入腸固有層淋巴管、腸系膜淋巴結，然后通過乳糜池進入血液循環，隨著肝動脈流入膽管周圍毛細血管叢并由此處侵入膽管上皮細胞。
子孢子鉆入上皮細胞后，很快擴大變成裂殖體，經過多次分裂后形成許多裂殖子。這些裂殖子從死亡的上皮細胞中溢出，繼續侵襲新的上皮細胞。在裂殖生殖階段，Pellerdy L P等曾提出有5代或6代，裂殖體可分為A、B兩型或三型。國內一般將裂殖生殖劃分為4代，并首次提出肝球蟲裂殖生殖具有多態現象，即裂殖體以多態方式產生下代裂殖子，包括子孢子型裂殖體、雙核或多核的裂殖子型裂殖體、單核裂殖子型裂殖體和經典型裂殖體。經過多次無性繁殖，裂殖子會分裂發育成兩性配子。兩性的大小配子發育成熟后，小配子進入大配子結合為合子，合子外面迅速包上被膜后形成卵囊并隨糞便排出體外。
剛從糞便中排出的卵囊還未孢子化，不能感染家兔。經過適宜的溫度、濕度和氧氣濃度的誘導，可發育成為具有感染力的孢子化卵囊。孢子化的完成意味著卵囊已具備感染力，過去曾經認為斯氏體的出現是孢子化完成的標志，但后來通過鏡檢觀察發現，在子孢子發育早期即出現斯氏體，因此將子孢子的可分辨度及折光體的出現作為孢子化完成的標志比較合理。
3 流行病學
各種品種和不同年齡的兔都可感染斯氏艾美耳球蟲，但以1月齡～3月齡的兔最易感而且病情嚴重，死亡率高。該病一年四季均可發生，陰雨季節多發，均呈地方性流行。斯氏艾美耳球蟲病在我國分布范圍很廣，重慶、甘肅、海南、河北、河南、青海、江蘇、山東、陜西、浙江、新疆等地均有報道。
4 致病性
患病的家兔通常表現出精神不振，食欲減退，動作遲緩，伏臥不動等癥狀。繼續發展會出現鼻腔、眼部分泌物及唾液分泌增多，并出現貧血、黃疸及腹瀉，虛弱消瘦，生長停滯。嚴重病例有時出現神經癥狀，站立不穩，四肢麻痹，病程較短，很快死亡[2]。剖檢發現感染嚴重的家兔肝臟高度腫大，肝臟表面及實質內有黃豆大小的沿膽小管分布的白色或淡黃色結節。對結節病灶進行鏡檢，可以看到各個發育階段的球蟲，肝實質發生局部壞死。膽管增生變大，管壁明顯增厚，膽管內充滿暗綠色膽汁，鏡檢可見到大量卵囊及脫落的上皮細胞和炎性細胞浸潤。有學者發現感染斯氏艾美耳球蟲后丙氨酸轉移酶、天冬氨酸轉移酶、堿性磷酸酶和γ谷氨酰轉肽酶活性升高，總蛋白、球蛋白、總膽紅素含量升高[3]。也有學者檢測了斯氏艾美耳球蟲感染兔的血常規、肝功能和凝血4項等血液指標，肝功能指標與其他學者的結果基本一致，還發現乳酸脫氫酶顯著增高，血清膽堿酯酶顯著降低[4]。對人工感染斯氏艾美耳球蟲后不同時間段血清中丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性進行檢測，發現感染初期丙二醛含量明顯升高，超氧化物歧化酶活性有明顯下降，但后期可逐漸恢復至正常水平，表明感染所致的病理氧化應激可通過肝臟代償維持[5]。
肝球蟲的感染造成肝細胞的損傷和壞死，影響肝臟的分解、合成、生物轉化及排泄功能，使得機體的代謝功能出現異常，最終導致家兔死亡。在一定的數量范圍內，家兔吞食的卵囊數越多，表現出的病理變化越明顯[6]。
5 診斷方法
5.1 卵囊漂浮檢測
改進的飽和食鹽水漂浮法，只取1粒糞便，加飽和食鹽水攪拌后過濾進青霉素瓶中，用吸管從液面前后左右中5個方向吸取表面糞液滴加于帶凹槽的載玻片上鏡檢。檢測出了包含斯氏艾美耳球蟲在內的7種球蟲，可節省取樣時間，操作簡便[7]。
5.2 組織病理學檢測
病理變化主要發生在肝臟，肝臟腫大并有結節病灶，鏡檢可觀察到肝臟組織變性壞死，肝膽管上皮增生，可見大量不同發育階段的蟲體[8]。
5.3 血清學檢測
Rose M E 采用補體結合試驗檢測感染斯氏艾美耳球蟲病家兔血清中的抗體，最早可在感染后3 d～7 d檢測到補體結合滴度的增加。Abu-El-Ezz N M T等[9]采用卵囊計數、組織病理學和ELISA進行診斷，發現使用卵囊抗原檢測抗體的ELISA可在感染后1周檢測到抗體，是早期診斷肝球蟲病的最佳方法。
魏聞芮等[10]建立了一種以斯氏艾美耳球蟲MIC-1和MIC-3重組蛋白為抗原診斷肝球蟲病的間接ELISA方法，敏感性和特異性都非常高，感染后第6、8、10天均能檢測到相應的抗體。
5.4 分子生物學檢測
Oliveir U C等[11]建立了一種基于ITS1序列作為靶標分子進行PCR擴增來鑒別診斷11種兔球蟲病的方法，種間無交叉反應，敏感性可達0.8個～1.7個孢子化卵囊。
閆文朝等[12-13]成功克隆了斯氏艾美耳球蟲完整的 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 序列，并以該序列為目的基因，建立了能有效檢測出50個斯氏艾美耳球蟲卵囊的靈敏性高、特異性強的PCR檢測方法。還以此為基礎建立了用于區分和鑒定斯氏艾美耳球蟲病、腸艾美耳球蟲病和黃艾美耳球蟲病的多重PCR診斷方法。
汪運舟等[14]建立了基于全基因組擴增技術的兔球蟲單卵囊PCR技術，能夠在單個卵囊的水平上進行蟲種鑒定，從而大大提高PCR反應的靈敏度。
Hassan K M等[15]提取了感染家兔糞便、全血樣本、肝組織的DNA，基于ITS1序列設計引物進行PCR檢測，發現最早可在感染后12 d從肝組織中檢測到PCR陽性。
梁子平等[16]以球蟲ITS1基因為種屬特異性檢測的PCR分子靶標，針對兔源11種艾美耳球蟲病建立了多重PCR聯檢方法,對檢測目標表現出了高敏感性和高特異性。該多重PCR聯檢方法平均最低可檢測到大約0.8個～1.7個的孢子化卵囊。
溫福利等[17-18]根據E.stiedaiITS1區域的基因保守序列設計引物，建立的實時熒光定量PCR方法特異性強，靈敏度高，可檢出含1個卵囊DNA的樣本，適用于感染初期的定量檢測。還根據E.stiedai的ITS1-5.8sRNA-ITS2 基因序列設計特異引物，建立了環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法，對待檢樣本進行10倍稀釋后，仍能夠檢測到36 copies/mL的DNA樣本，具有特異性和較高的敏感性。
6 免疫學
用免疫組化鏈霉親和素-生物素復合物法對斯氏艾美耳球蟲感染后家兔體內球蟲抗原的分布進行觀察，發現肝臟竇狀隙、膽管上皮細胞、肝門淋巴結和脾臟內有明顯的棕黃色陽性反應區，說明這些區域和部位有相應的E.stiedai抗原存在，且抗原數量最多的是肝臟，其次為脾臟，肝門淋巴結最少[19]。試驗證明，斯氏艾美耳球蟲感染家兔后可以激發體液免疫應答，產生的特異性抗體能夠作用于卵囊抗原和糞便抗原，抗體水平高低能夠說明保護性免疫應答水平的高低。
6.1 活疫苗
不同劑量的γ射線輻射可以不同程度地降低斯氏艾美耳球蟲的致病性，45 krad的γ射線輻射劑量仍不能使孢子化卵囊致死。雖不能使接種動物發病，但能使動物感染，刺激機體產生相當程度的免疫保護力。
有學者用超聲處理的卵囊免疫家兔，發現免疫組的卵囊產出要低于未免疫組，而血清抗體水平則高于未免疫組[20]。
6.2 亞單位疫苗
Hanada S等用從感染兔的膽汁中提取的裂殖體抗原免疫無球蟲兔，發現免疫兔的膽管周圍聚集較多的炎性細胞，而蟲體較少，排卵量也少于未免疫的兔。Omata Y等用感染15 d后膽汁中的子孢子和裂殖體抗原免疫兔后再攻蟲，免疫組卵囊排出數量比對照組少。Abdel K N等用糞抗原加弗氏佐劑免疫接種無球蟲兔后，經口攻毒孢子化卵囊。結果顯示，免疫組排出的卵囊數量減少，體液免疫應答水平也比對照組高，可以提供70%的免疫保護力。
6.3 疫苗候選基因與基因工程苗
有學者成功將微線蛋白和肌動蛋白解聚因子基因進行克隆并在真核細胞中進行了表達，也有學者原核克隆表達了菱形體蛋白、熱休克蛋白、天冬氨酸蛋白酶基因并進行了Western blot分析[21-26]。
有研究者構建了微線蛋白與白介素IL-15共表達真核載體，并轉入減毒鼠傷寒沙門菌，免疫試驗結果表明，該重組菌能誘導機體產生較高水平的抗球蟲細胞免疫應答和體液免疫應答，抗球蟲指數達到160以上，具有中等抗球蟲效力[27]。
7 藥物治療
由于還沒有研究出商品化疫苗，目前斯氏艾美耳球蟲病的防控主要依靠藥物，妥曲珠利、地克珠利、α-二氟甲基鳥氨酸、莫能菌素、鹽霉素、馬杜拉霉素、拉沙洛菌素等都在臨床中有應用。
趙愛云等[28]觀察了3種抗球蟲藥對斯氏艾美耳球蟲病的敏感性，結果表明，球蟲血痢散(主要成分為磺胺喹噁啉)的增重效果較好,但是不能很好地抑制卵囊排出;球蟲血痢清(主要成分為鶴虱、檳榔、雷丸等14種中藥)在增重和抑制卵囊排出這兩方面效果都比較好;試驗蟲株已經對兔血痢靈(主要成分為鹽酸氯苯胍)產生了一定的耐藥性。
Al-Mathal E M[29]觀察了橄欖科植物沒藥(Commiphoramolmol)對兔肝球蟲病的治療效果，發現沒藥的商業化提取物Mirazid和天然產物都可以降低卵囊排出量，最終達到治愈的效果，但Mirazid更高效。
Baghdadi H B等[30]通過試驗證實黑種草(NigellasativaL.)的種子混懸劑和油乳劑是一種安全有效的治療斯氏艾美耳球蟲病的藥物。
王璽德等[31]通過試驗證明灌服石榴皮水提物后，家兔排出的斯氏艾美耳球蟲卵囊的比重顯著減少;飼喂鹽酸氯苯胍的家兔，排出卵囊的比重也減少。
宋宏曉等[32]對比了癸氧喹酯與妥曲珠利對斯氏艾美爾球蟲病的治療效果，發現在平均增重、卵囊排出量、病變記分方面，兩組差異顯著，妥曲珠利效果優于癸氧喹酯。
Indrasanti D等[33]發現大蒜提取物對斯氏艾美耳球蟲的卵囊形成有一定抑制作用。
蘭家花[34]在一份感染斯氏艾美耳球蟲家兔的診治報告中，采用氯苯胍按每千克精料加100 mg混合均勻;磺胺六甲氧嘧啶，按每千克精料加1 g混飼1周并配合飼養管理，用藥3 d～5 d后患兔病情開始好轉，用藥2個療程后，未見幼兔死亡，疫情得到有效控制。
Eladl A H等[35]使用商業化的植物提取物Herba Cox?治療人工感染斯氏艾美耳球蟲病的家兔，感染前7 d到感染后28 d連續使用，可以減輕臨床癥狀，改善肝臟功能，減少卵囊排出，是一種新型安全高效的治療方法。
從以上研究可以看出，對于抗斯氏艾美耳球蟲病藥物的研究，有從傳統化學藥物轉向天然草本藥物、從治療為主轉向預防為主的趨勢。
8 展望
目前對斯氏艾美耳球蟲病的防控仍是以藥物防治為主，疫苗研究尚未取得實質性進展，還沒有商業化疫苗問世。但是，隨著基因組學的發展，更多的疫苗候選基因將被篩選評估，相信不久的將來就可以研制出安全高效的基因工程疫苗，給養兔業帶來福音。
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